免疫性血小板减少症患儿外周血T淋巴细胞相关细胞因子水平变化

刘 豹，石太新，赵东菊，李培岭，肖爱菊，田运娇，王彦华，范 蕊，任瑞娟，郭路阳

(新乡医学院第一附属医院儿科，河南 卫辉 453100)

儿童免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP) 是儿童最常见的出血性疾病，是一种以血小板减少为主要表现的免疫相关疾病，以皮肤黏膜自发性出血、血小板减少等为主要特点。大部分患儿临床治疗效果较好，但仍有部分患儿迁延不愈，转变为慢性，甚至因重要脏器出血而死亡，给患儿家庭带来沉重的经济及心理负担。因此，进一步了解ITP的发病机制，对于临床治疗至关重要。近年研究发现，辅助性T(T-help，Th)细胞及细胞因子之间的平衡在ITP的发生、发展中起重要作用，但目前对于ITP患儿Th细胞功能紊乱的研究仍存在争议[2-4]。本研究采用流式细胞微球阵列(cytometric bead array，CBA)技术检测新诊断ITP患儿治疗前后外周血中T淋巴细胞相关细胞因子水平的变化，旨在探讨细胞因子与ITP发病机制的关系，以期为ITP的临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2016年7月至2017年10月新乡医学院第一附属医院小儿内科收治的ITP患儿为观察对象，均符合ITP诊断标准[5]，所有患儿行骨髓细胞学检查，在排除存在明确感染、肿瘤、免疫缺陷、自动出院及标本收集不符合要求等因素后，最终确定纳入研究的新诊断ITP患儿40例为观察组，其中男30例，女10例；年龄26 d至9岁，平均(36.7±31.4)个月。并选择同期门诊体检的健康儿童31例为对照组，其中男21例，女10例；年龄1月22天至7岁，平均(38.5±25.3)个月。2组受试者的性别及年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，血液标本采集获得患儿家属的知情同意。

1.2主要试剂与仪器人Th1细胞因子白细胞介素(interleukin，IL)-2、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)及Th2细胞因子IL-4、IL-6、IL-10和Th17细胞因子IL-17A试剂盒、FACSCalibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)，普通高速离心机(美国Thermo公司)，-80 ℃冰箱(中科美菱低温科技有限责任公司)，离心管(美国Axygen公司)。

1.3治疗方法按照2013年中华医学会儿科学分会血液学组制定的《儿童原发性免疫性血小板减少症诊疗建议》[5]，观察组患儿给予人免疫球蛋白(华兰生物工程股份有限公司，国药准字S10970032)1.0 g·kg-1·d-1，静脉输注，连用1～2 d；醋酸泼尼松片(山东鲁抗辰欣药业有限公司，国药准字H37021900)1.5～2.0 mg·kg-1·d-1，分2次口服(最大不超过60 mg·d-1)，血小板≥100×109L-1后稳定1～2周，逐渐减量直至停药，一般疗程4～6周。

1.4标本采集及处理观察组患儿无菌采集治疗前及治疗后连续第3次血小板计数≥100×109L-1时的外周静脉血2 mL，对照组儿童无菌采集体检当日外周静脉血2 mL，均常温自然凝固 30 min 后，3 000 r·min-1离心10 min，取上层血清分装至离心管中，-80 ℃冰箱保存。

1.5血清T淋巴细胞相关细胞因子测定收集的血清标本自然状态下常温解冻，取40 μL血清，依照试剂盒说明书方法处理样本，使用流式细胞仪检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ及IL-17A水平，采用FCAP分析软件对收集数据进行处理和分析。

2 结果

2.12组受试者血清细胞因子水平比较结果见表1。观察组患者治疗前血清IL-2、IL-6、TNF、IFN-γ、IL-17A水平显著高于对照组受试者，而IL-4、IL-10水平显著低于对照组受试者，差异均有统计学意义(P<0.05)。观察组患者治疗后血清IL-2、IL-6、TNF、IFN-γ、IL-17A水平较治疗前显著降低，而IL-4、IL-10水平较治疗前显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。观察组患者治疗后血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ、IL-17A水平与对照组受试者比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表12组受试者血清细胞因子水平比较

组别nIL-2/(ng·L-1)IL-4/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)IL-10/(ng·L-1)TNF/(ng·L-1)IFN-γ/(ng·L-1)IL-17A/(ng·L-1)对照组315.19±0.073.09±0.052.08±0.093.34±0.161.93±0.052.04±0.061.69±0.02观察组40 治疗前6.51±0.36a1.11±0.18a6.94±0.83a2.48±0.25a3.67±0.57a4.48±0.89a6.31±0.83a 治疗后5.09±0.16b2.90±0.18b2.26±0.43b3.94±0.38b2.11±0.31b2.22±0.29b2.16±0.33b

注：与对照组比较aP<0.05；与观察组治疗前比较bP<0.05。

2.2观察组患者血清细胞因子水平与血小板计数的相关性结果见表2。观察组患者血清各细胞因子水平与血小板计数无显著相关性(P>0.05)。

表2观察组患者7种细胞因子与血小板计数相关性分析

Tab.2Correlationanalysisofsevencytokinesandplateletscountintheobservationgroup

血小板IL-2IL-4IL-6IL-10TNFIFN-γIL-17Ar-0.127-0.114-0.054-0.1460.2030.087-0.028P0.4340.4850.7410.3700.2080.5920.862

2.3观察组患者各血清细胞因子之间的相关性结果见表3。观察组患者血清IL-2与IL-6呈正相关(r=0.382，P=0.00)，IL-6与IFN-γ呈正相关(r=0.759，P=0.00)。其他细胞因子之间比较无相关性(P>0.05)。

表3观察组患者血清细胞因子之间的相关性

Tab.3Correlationanalysisbetweensevencytokinesintheobservationgroup

IL-2IL-4IL-6IL-10TNFIFN-γIL-17AIL-21.000IL-4-0.0871.000IL-60.382-0.0431.000IL-100.043-0.156-0.1181.000TNF-0.103-0.2260.348-0.0171.000IFN-γ0.4220.0630.7590.0360.1881.000IL-17A0.0730.4080.1310.010-0.1880.2131.000

3 讨论

ITP是主要由免疫功能异常引起的一种自发性出血性疾病，以单纯性血小板减少为特征[6]，是儿童常见的出血性疾病之一，具有自限性[7].临床根据ITP患儿病程长短分为3型[8]：(1)新诊断的ITP：确诊后<3个月；(2)持续性ITP：确诊后3～12个月；(3)慢性ITP：确诊后>12个月以上。ITP可发生于任何年龄段，相关流行病学统计显示，成人ITP 年发病率为5/10万～10/10万[9]，儿童ITP年发病率为1.9/10万～6.4/10 万[10]，儿童患者中以新诊断ITP比较常见，发病年龄主要集中在2～5岁，病程一般4～6周，多数患儿病情可自行缓解，预后较好，但仍有约20%的急性ITP发展成慢性或难治性ITP[11]。

ITP的发病机制尚未完全明确，以往认为是机体体液免疫功能紊乱所致，但随着研究的不断深入，发现ITP患者除体液免疫功能紊乱，产生自身抗血小板抗体外，还存在T细胞亚群及其相关细胞因子的失衡。Th细胞根据其产生的细胞因子和功能不同可分为Th1细胞、Th2细胞及Th17细胞等。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF等细胞因子，介导细胞免疫应答；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等细胞因子，参与体液免疫应答；Th17细胞是由初始T细胞前体分化，具有独立的分化和发育调节机制，分泌IL-17A细胞因子，介导炎性反应，在自身免疫性疾病、肿瘤和移植排斥等疾病的发生、发展中发挥重要调节作用。正常情况下，Th1/Th2细胞保持动态平衡，以维护机体处于相对稳定的状态。一旦这种平衡遭到破坏，则会导致Th极化，进而出现各种免疫相关性疾病[12-13]。

研究发现，ITP患儿体内存在Th1/Th2平衡失调，以Th1优势为主[14]，但也有部分学者研究显示以Th2细胞优势为主[15]。本研究通过CBA技术测定新诊断ITP患儿外周血中Th1/Th2细胞因子，结果显示，观察组ITP患儿血清IL-2、IL-6、TNF、IFN-γ水平明显高于对照组健康儿童，而IL-4、IL-10水平则低于健康儿童；在经过一线治疗后，观察组患儿血清IL-2、IL-6、TNF、IFN-γ水平较治疗前显著降低，IL-4、IL-10水平较治疗前显著升高，且与对照组健康儿童比较差异无统计学意义。IL-2在细胞免疫应答中起到促进、维持T细胞活化增殖的作用，促进所有亚型T淋巴细胞活化增殖及产生细胞因子，在ITP患者体内IL-2可通过促进T细胞的直接细胞毒效应导致血小板破坏增加。IFN-γ具有强大的免疫调节作用，可促进B细胞增殖分化为浆细胞，使免疫球蛋白分泌增加，即血小板相关抗体分泌增多，使巨噬细胞对血小板的破坏增强。TNF在体内可促进T细胞主要组织相容性复合体Ⅰ类抗原的表达，增强IL-2依赖的胸腺细胞和T细胞的增殖能力，促进IL-2、IFN-γ等细胞因子的产生。IL-4可以促进Th2细胞分化，但抑制Th1细胞增殖及其应答等，在自身免疫性疾病中有重要作用。IL-6是一种多功能细胞因子，可促进B细胞分泌抗体及增生分化，具有活化T细胞和自然杀伤细胞、促进血细胞增殖[16]、免疫调节、造血调控及抗肿瘤等作用。IL-10是一种细胞因子合成抑制因子[17]，能通过抑制Th1细胞亚群分泌IFN-γ和 IL-2，影响T细胞亚群的分化与成熟。本研究结果显示，观察组患儿体内存在明显的细胞因子失衡，表现为Th1细胞因子优势为主，推测这些细胞因子通过不同的方式参与了ITP的发生、发展，同时也间接证明了ITP患儿体内存在Th1细胞数量增多和(或)功能活跃，即存在Th1优势。

Th17细胞是最近发现的不同于Th1、Th2的新型CD4+T细胞亚群，主要分泌IL-17A/F、IL-22、IL-21等多种细胞因子，其中IL-17A(即常说的IL-17)是Th17的特征性细胞因子，在自身免疫性疾病中可加剧疾病的病理过程。曹利佳[18]研究发现，急性ITP患儿外周血淋巴细胞中IL-17 mRNA及IL-17表达明显高于对照组。但常大雨等[19]研究发现，活动组、未缓解组和缓解组慢性ITP患者血浆IL-17的表达与正常对照者无明显差异。本研究发现，观察组患儿治疗前血清IL-17A水平显著高于对照组健康儿童，在经过一线治疗后，观察组患儿血清IL-17A水平较治疗前明显降低，且与对照组健康儿童比较差异无统计学意义，与曹利佳[18]研究结果一致。YE等[20]研究发现，IL-17A有保护B细胞的作用，可使其免受凋亡，并促进B细胞增殖与分化。本研究结果显示，ITP患儿体内IL-17A明显升高，提示存在Th17优势。由此推测，IL-17A升高增强了B细胞增殖与分化的能力，从而产生更多的抗血小板抗体，促进了ITP的发生、发展。

然而在ITP患者体内，T淋巴细胞及其相关的细胞因子相互作用、互相影响，共同介导了疾病的发生、发展。李培岭等[14]研究发现，ITP患儿血清中IFN-γ与IL-4呈明显负相关。罗洪强等[21]研究发现，初治ITP患者治疗前外周血IL-2/IL-4比值与血小板计数呈负相关。本研究对观察组患儿治疗前后7种细胞因子进行相关性分析，发现IL-6与IL-2、IFN-γ之间存在正相关，说明在ITP患儿体内IFN-γ不仅可以抑制Th2细胞分化及其细胞因子合成，还可以促进IL-6的分泌，不仅促使了B细胞增殖、分化并产生抗血小板抗体，介导血小板的破坏，而且还促进IL-2分泌和T细胞表面IL-2受体表达，通过T细胞的直接细胞毒效应导致血小板破坏增加，并进一步促进Th1细胞分化，从而分泌更多的Th1细胞因子，最终通过复杂的细胞因子网络，形成了体内Th1优势的局面。因此，Th1/Th2相关细胞因子在介导细胞免疫的同时又参与体液免疫，在ITP的发病中起着重要作用。而本研究未发现IFN-γ与IL-4之间具有明显相关性，且各细胞因子与血小板计数之间也未见明显相关性，考虑存在以下可能原因：(1)ITP发病机制复杂，患儿体内免疫功能紊乱，存在多种免疫细胞及细胞因子失衡，且受疾病状态及个体差异的影响较大；(2)本次研究观察组样本量较少，可能对实验结果有一定影响。对于细胞因子与血小板计数的关系，有待于进一步的研究。

综上所述，在新诊断ITP患儿体内存多种T淋巴细胞细胞因子紊乱，以Th1、Th17细胞因子升高为主，提示T淋巴细胞相关细胞因子也参与了ITP的发生，ITP患儿体内存在Th1、Th17优势。深入研究T淋巴细胞及其相关细胞因子与ITP的关系，将有助于进一步揭示ITP的发病机制，为ITP患者的治疗提供参考。