清肠温中方促进DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠结肠claudin-l、claudin-4表达修复肠黏膜屏障的机制研究＊

毛堂友，裴文静，史 瑞，赵兴杰，王志斌，陈晓伟，陈 晨，

石 磊，谭 祥，孙中美，丁庞华，李军祥＊＊

（北京中医药大学东方医院脾胃肝胆科 100078北京）

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是炎症性肠病的两种形式之一，主要发生于结肠和直肠[1]，好发于年轻人，其腹痛、腹泻、黏液脓血便等临床症状严重影响患者的生活质量，被世界卫生组织列为现代难治病之一[2]，也是目前消化领域的研究热点。UC病程迁延不愈，复发率相当高，UC的严重并发症——UC相关性结直肠癌的检出率明显升高，占UC患者死亡原因的10%-15%[3]。UC的发病率和患病率与经济的发展程度呈现一定的相关性，主要见于北美和欧洲等发达国家。研究[4]显示，北美地区UC的发病率约为37.5-248.6/10万人/年，欧洲地区约为4.9-505/10万人/年。亚洲UC患者病率及患病率较西方国家低，但近20年来呈逐年增加趋势，尤其是日本、南韩、新加坡等[5]，Prideaux等[6]调查显示，目前UC的发病率约为7.6-14.3/10万/年，患病率为2.3-63.6/10万/年。目前其发病机制尚未完全阐明。研究显示[7]，紧密连接蛋白的异常表达，从而直接影响肠黏膜屏障功能，是造成溃疡性结肠炎的重要发病机制。本课题组前期研究[8,9]发现，清肠温中方能够明显改善溃疡性结肠炎患者的临床症状，抑制炎症反应，修复肠粘膜损伤，但具体机制尚不清楚。因此，本研究将从肠黏膜屏障紧密连接蛋白claudin-1和claudin-4入手，进一步探讨清肠温中方治疗溃疡性结肠炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级SD雄性大鼠（200±20）g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司（许可证号：SCXK（京）2011-0004），饲养于中国中医科学院中药研究所。12小时光照/黑夜循环，温度（20-24）℃，湿度50-60%；自由饮食饮水饲养。

1.2 药物

美沙拉嗪肠溶片（mesalazine）购自德国Losan Pharma GmbH公司。清肠温中方（黄连6 g，炮姜10 g，三七6 g，青黛6 g，地榆炭15 g，苦参15 g，木香6 g，炙甘草6 g）购自北京中医药大学东方医院颗粒药房。

1.3 试剂与仪器

葡聚糖硫酸钠（MW36-50KDa；MP Biomedical,Burlingame,CA,USA）,便潜血试纸（珠海贝索生物技术有限公司）；NF-κB抗体（abcam，Ab16502），Claudin-1抗体（abcam，Ab15098），Claudin-4抗体（Santa cruz，Sc-376643），Beta actin抗体（中杉金桥，TA-09）。

1.4 分组、造模及标本采集

动物模型的建立方法如前期研究[5]，概述如下：自由饮用4.5%DSS溶液制备大鼠UC模型，将60只健康SPF级雄性SD大鼠（体重200±20 g）适应性饲养1周后，以4.5%DSS(MW：36000-50000，MP Biomedical)溶液自由饮水7天，普通饲料喂养，同时运用随机数字表法将大鼠随机均等分为分为6组：正常组，模型组，清肠温中方低剂量组、中剂量组、高剂量组，美沙拉嗪组。自由饮用4.5%DSS溶液的同时，各组均以相应药物灌胃治疗7天。每日称取大鼠体重，观察大便性状，检测便潜血，干预结束后，禁食不禁水24 h后取材，分离远端结肠10 cm，-80℃冻存备用。

1.5 Real time-PCR检测结肠Claudin-1、Claudin-4基因表达

提取结肠组织样本的总RNA，逆转录后进行PCR扩增，Claudin-1上游引物CACTTCCAGACTCCAC⁃CACC，下游引物 AATCTTCCATTGGGGCAGGG，扩增片段长度275bp；Claudin-4上游引物AGCAATGACT⁃GGGGCCTTAC，下游引物 CCTAGCACTCCCCAAAC⁃CAG，扩增片段长度115 bp；内参GAPDH上游引物CCCATCTATGAGGGTTACGC，下游引物 TTTAATGT⁃CACGCACGATTTC，扩增片段长度150 bp。PCR产物经电泳后，各种统计2一△△CT法进行数据的相对定量分析，计算Claudin-1、Claudin-4值。

1.6 Western blot检测结肠Claudin-1、Claudin-4蛋白表达

将结肠组织裂解后，离心取上清液，置于BSA标准液中，检测样品蛋白含量。调整浓度后，进行电泳分离，分别加入claudin-1和claudin-4一抗以及二抗，漂洗后显影、定影，图像分析。

1.7 免疫组织化学检测结肠NF-κB p65的表达

结肠组织石蜡切片（4 μm）经过酒精脱水、二甲苯脱蜡、抗原修复、封闭后，进行免疫组织化学染色（NF-κB p65抗体浓度1∶2000，Beta actin抗体浓度1∶1000），以PBS为阴性对照，200倍镜视野下采集图片，image pro plus 6.0软件分析图像，计算光密度(IOD)和染色区域总面积（area），用平均光密度（IOD/area）来进行统计分析。

1.8 统计学处理

所有的数据均以均值±标准差（）表示，采用SPSS 17.0统计软件（IBM Corp,Armonk,NY,USA）分析，符合正态分布且方差齐进行单因素方差分析（One-way ANOVA），不符合正态分布或方差不齐进行非参数检验，均为组间比较，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 清肠温中方对DSS诱导UC大鼠结肠claudin-1的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠claudin-1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，清肠温中方中剂量组、高剂量组和美沙拉嗪组大鼠结肠claudin-1的mRNA表达水平均显著升高（P＜0.05），清肠温中方各剂量组和美沙拉嗪组大鼠结肠claudin-1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。见表1，图1。

2.2 清肠温中方对DSS诱导UC大鼠结肠claudin-4的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠结肠claudin-4的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，清肠温中方中剂量组、高剂量组和美沙拉嗪组大鼠结肠的claudin-4的mRNA和蛋白水平均显著升高（P＜0.05）。见表2、图2。

2.3 清肠温中方对DSS诱导UC大鼠结肠NF-κB p65的影响

NF-κBp65在正常组大鼠结肠组织中的阳性表达很少或几乎没有表达。在模型组及各治疗组中，主要可见于病变结肠粘膜组织的肠黏膜层、黏膜肌层、肌层、浆膜层，而各治疗组较模型组的表达相对较少，其组织切片阳性表达染色主要为深棕黄色或褐色，图3。

表1 清肠温中方对DSS诱导UC大鼠结肠claudin-1的影响（）

表1 清肠温中方对DSS诱导UC大鼠结肠claudin-1的影响（）

组别正常组模型组清肠温中方低剂量组清肠温中方中剂量组清肠温中方高剂量组美沙拉嗪组n 10 10 10 10 10 10 claudin-1mRNA 1.67±0.54 0.86±0.23##1.09±0.62 1.17±0.24*1.31±0.32*1.28±0.38*claudin-1蛋白0.42±0.04 0.14±0.07##0.24±0.08*0.29±0.05*0.31±0.02*0.35±0.04*

图1 清肠温中方对DSS诱导UC大鼠结肠claudin-1蛋白表达的影响

与正常组相比，模型组NF-κBp65的平均光密度明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，清肠温中方中剂量组、高剂量组和美沙拉嗪组大鼠结肠的NF-κB p65平均光密度显著降低（P＜0.05），见表3。

表2 清肠温中方对DSS诱导UC大鼠结肠claudin-4的影响（）

表2 清肠温中方对DSS诱导UC大鼠结肠claudin-4的影响（）

组别正常组模型组清肠温中方低剂量组清肠温中方中剂量组清肠温中方高剂量组美沙拉嗪组n 10 10 10 10 10 10 claudin-4mRNA 1.20±0.38 0.71±0.21#0.83±0.32 0.99±0.17*1.02±0.24*1.00±0.19*claudin-4蛋白0.42±0.04 0.14±0.07##0.24±0.08 0.30±0.04*0.31±0.02*0.35±0.04*

图2 清肠温中方对DSS诱导UC大鼠结肠claudin-4蛋白表达的影响

3 讨论

图3 清肠温中方对UC大鼠结肠NF-κB p65蛋白的影响（IHC，×200）

UC的发病机制仍未完全阐明，目前大多学者认为持续肠道感染、肠黏膜屏障缺损、肠黏膜免疫调节异常、遗传和环境等因素共同参与了疾病发生过程，其中，肠黏膜屏障受损是溃疡性结肠炎发病的关键因素[6]。肠黏膜屏障由机械屏障（肠黏膜上皮细胞）、化学屏障（黏膜表面黏液层+消化液等）、免疫屏障（相关淋巴组织细胞群和黏膜分泌的免疫球蛋白）和生物屏障（肠道菌群）等4个方面共同构成[7]。机械屏障是机体防御的第一道防线，由肠黏膜上皮细胞及其细胞间的连接组成，后者主要包括紧密连接（tight junction，TJ）、粘附连接（adherens junctions，AJ）和缝隙连接（gap junction，GJ），而其中TJ是肠上皮细胞间的主要连接方式，在维持肠上皮细胞极性和调节肠黏膜屏障的通透性中发挥着重要的作用。

TJ是由一系列蛋白、脂肪组成的复合体，连续地存在于细胞与细胞之间。TJ主要有两大功能：一是“屏障功能”，即调节着离子、水分子、大分子甚至癌细胞的通路；二是“篱笆”功能，则主要与保持细胞极性有关，阻止在顶膜部位的分子与在侧膜的分子相互混合[8]。因此，当紧密连接的完整性受到破坏时，肠上皮紧密连接功能的缺失（又称为“漏肠”），可引起肠上皮通透性增加[9,10]，肠道的细菌、病毒及其他微生物、物中的大分子蛋白等即可通过受损的紧密连接进入机体，引起免疫反应，引发一系列疾病，溃疡性结肠炎的发病也与此相关。紧密连接蛋白是TJ的主要组成部分，包括跨膜蛋白家族（claudin蛋白、occludin蛋白）、结肠黏膜扣带蛋白（cingulin）、连接黏附分子（junctional adhe⁃sion molecules,JAMs）、膜周蛋白家族（zonula occlu⁃dins，ZOs）等结构蛋白及各类连接蛋白分子，它们通过肌动蛋白和肌球蛋白II与细胞骨架相连[11,12]。紧密连接蛋白在维持肠黏膜屏障功能及调控细胞间通透性发挥着关键作用，因此，紧密连接蛋白的异常表达，则会直接影响肠黏膜屏障功能，这也是溃疡性结肠炎的重要发病机制之一[13]。因此，寻求对肠上皮紧密连接具有保护作用的药物，对治疗溃疡性结肠炎具有重要的意义。

Claudins蛋白是构成紧密连接的主要骨架蛋白，是维持和调节细胞旁通透性关键蛋白。Claudin-1是最早分离出来的紧密连接蛋白，是构成紧密连接的主要骨架蛋白之一，在维持肠粘膜上皮细胞屏障功能和紧密连接的完整性发挥着关键作用。研究表明[14]，Claudin-1的表达减少或结构破坏时，可引起黏膜屏障功能紊乱，导致紧密连接功能失调和组织渗透性的增加，使得肠上皮细胞通透性增加，肠腔外源性抗原进入，免疫反应异常亢进，从而促进溃疡性结肠炎的发生发展。Claudin-4蛋白作为紧密连接蛋白家族成员之一，共有209个氨基酸组成，主要分布在肺、肾、肠和脑中，编码基因定位于人类染色体7q11.23。Claudin-4蛋白一方面可以维持上皮细胞完整性，加强细胞间的连接，起到屏障作用，另一方面，在细胞顶端形成了紧密连接线，把上皮细胞质膜分成顶侧的脂质部分和基侧的蛋白部分，并阻止它们之间的相互弥散，以保持细胞的极性[15]。当claudin-4蛋白表达减少时，可破坏紧密连接复合体的结构，导致肠道黏膜屏障功能受损，进而引起抗原移位、免疫损伤，促进溃疡性结肠炎的发生。另外，研究表明，溃疡性结肠炎与NF-κB密切相关[16,17]。当机体受到脂多糖等外界刺激时，NF-κB会与IκB分离，进入细胞核，调控IL－6、TNF-α等炎性细胞因子的表达，引起机体炎症反应，同时下调claudin-1、claudin-4等紧密连接蛋白的表达，造成肠黏膜屏障受损，促进UC的发生发展[18,19]。

表3 清肠温中方对DSS诱导的UC大鼠结肠NF-κB p65的影响（）

表3 清肠温中方对DSS诱导的UC大鼠结肠NF-κB p65的影响（）

注：与正常组比较,##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05

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本次实验研究发现，模型组大鼠claudin-l、clau⁃din-4的基因和蛋白水平较正常组降低（P＜0.01，P＜0.05），提示提示DSS可抑制大鼠结肠黏膜紧密连接蛋白claudin-l、claudin-4的表达，而经过清肠温中方的干预后，结肠claudin-l、claudin-4的mRNA和蛋白水平均显著升高（P＜0.05）。由此可以推测，清肠温中方能够通过上调claudin-l、claudin-4的表达，修复损伤的结肠黏膜屏障。而进一步研究发现，与正常组相比，模型组大鼠结肠NF-κB p65的平均光密度水平均显著升高（P＜0.01）；而经过清肠温中方的治疗后，中剂量组、高剂量组大鼠结肠NF-κB p65的平均光密度水平显著降低（P＜0.05），由此说明，清肠温中方可能是通过抑制NF-κB p65的表达，抑制肠道炎症反应，从而促进紧密连接蛋白claudin-l、claudin-4的表达水平，修复肠粘膜损伤，达到治疗UC的目的。清肠温中方是本课题组李军祥教授根据多年临床经验而创立的经验方，主要用于寒热错杂、湿热瘀阻证的溃疡性结肠炎，主要由黄连6 g炮姜10 g三七6 g青黛6 g地榆炭15 g苦参15 g木香6 g炙甘草6 g等组成，其中黄连清热利湿、厚肠止泻，炮姜温经止血、健脾止泻，二者合为君药，一寒一温，意在调和阴阳、平调寒热；苦参清热燥湿，青黛清热解毒、凉血消斑，三七化瘀止血，三者共为臣药，佐均药清热利湿，同时还可入营血，凉血、活血、止血；木香行气止痛，地榆炭凉血止血、解毒敛疮，二药共为使药，一气一血，具有行气止血的功效；炙甘草为使药，调和诸药，同时还具有补中益气的作用。本方主要针对脾胃虚寒为本，湿热瘀阻为标的证型，其中“清肠”，即清利肠道湿热，与本研究中下调NF-κB p65的表达而抑制肠道炎症反应相对应；而“温中”，即温补中焦脾胃，增强卫气的防御功能，与本研究中清肠温中方促进紧密连接蛋白claudin-l、claudin-4的表达水平而修复肠粘膜损伤相类似。

本次研究通过动物实验探讨了清肠温中方通过抑制NF-κB p65、促进claudin-l、claudin-4治疗溃疡性结肠炎的作用机制，但是其上下游的调控机制尚不清楚，另外中药的作用往往是网状调控的，本研究所示的claudin-l、claudin-4是否是发挥作用的主要途径？还有没有其他通路，甚至是其主要作用的通路或者靶点？这些目前均不得而知。因此，下一步，我们需要深入研究相关的上下游靶点，并扩充思路，深入研究肠道菌群、肠黏膜免疫等方向的研究，从而完善清肠温中方治疗溃疡性结肠炎的作用机制。