以碱性聚合酶2(PB2)为靶点的抗流感病毒药物的虚拟筛选

王 强，石 桥，刘 金

(中南民族大学 药学院，武汉 430074)

流感病毒可分为A,B,C三型，A型流感能频繁引起全国性和季节性流感，猪类和禽类都可以作为A型流感的宿主；B型流感能引起流行性感冒甚至可导致人类死亡，尤其是儿童[1-3].美国抗流感病毒药物的现行标准是神经氨酸酶抑制剂(NAIs)奥司他韦和扎那米韦，这些药物对于A型和B性流感有效，但神经氨酸酶抑制剂对于严重病症效果轻微，必须在感染的24～48 h内摄入[4]，且易产生耐药性[5]，尤其是H5N1流感已经表现出了对奥司他韦的耐药性[6].

流感病毒基因组含有8个RNA片段，可编码11种病毒蛋白质，由PA,PB1和PB2这3个亚基组成的聚合酶复合体是病毒基因组RNA复制和mRNA转录的关键组分，由于它突变率低、高度保守，成为抗流感病毒药物设计的重要靶点.在宿主细胞核中，这种聚合酶通过一种称为“cap-snatching”的方式来转录vRNA[7].在转录过程中，PB2的帽结合区域结合到宿主前信使5′端帽子结构上[8]，帽子和帽子下游的10～13核苷酸被聚酰胺的N端核酸内切酶区域分开，随后产生的5′帽子RNA片段被PB1亚基用作合成的病毒mRNA的引物[9, 10]. PB2通过影响“cap-snatching”的转录过程对病毒复制十分重要，对帽结合、核酸内切酶或聚合酶的抑制剂，都是抗病毒治疗的潜在手段，成为积极研发的作用靶点[11, 12].

PB2成为抗病毒治疗的靶点不久后，Michael P. Clark以环烷基并哌啶基氯氮杂吲哚为母核进行优化，得到化合物VRT-0761704，m7GTP和VRT-0761704与PB2的帽结合区域结合的X光晶体结构被成功确认[3].尽管分属于不同空间的PB2帽结合部分,但与之前m7GTP 的结果一致[13]，结构揭示VRT-0761704占据了m7GTP的结合区域并产生同m7GTP鸟嘌呤相似的与蛋白质之间的连接.Michael P.Clark的实验显示m7GTP和VRT-0761704均与侧链GLU361和LYS376形成氢键.VRT-0761704的氮杂吲哚部分被夹在芳香性侧链HIS357和PHE404，嘧啶环上的大π键与PHE323排斥.VRT-0761704的二甲基丙酰胺位m7GTP的核糖和α-磷酸盐附近.同时，他们还发现化合物VX-787也在体外表型细胞保护试验中对大多数A型流感表现出强力的抗病毒活性——包括对神经氨酸酶抑制剂和金刚烷胺有耐药性的流行性流感H1N1和H5N1，并且活性只针对A型流感，对B型流感只有微弱的作用[14](见图1).

SPECS数据库(www.specs.net)由荷兰SPECS公司于1987年开发，其中所有化合物均可在SPECS公司购买，数据库会根据各个化合物的库存量定期更新.为了使筛选的结果更加准确可靠，防止漏筛，本研究针对已报道的两种大分子结构相同但结合小分子不同的晶体结构，以PB2为靶点，使用分子对接技术筛选数据库中潜在的抑制剂，发现2个高活性的PB2抑制剂，探讨了抑制剂与PB2之间的结合模式，对以PB2为靶点的抗病毒药物研究有重要意义.

图1 碱性聚合酶2抑制剂Fig.1 PB2 inhibitors

1 实验方法

1.1 配体小分子的准备

利用SPECS数据库(www.specs.net)设定：1)化合物的分子量不大于550；2)化合物结构中的氢键供体(包括羟基、氨基等)的数量不大于5个；3)化合物中氢键受体的数量不大于10个；4)化合物的脂水分配系数的对数值(logP)不大于5；5)必须含有1个以上芳环结构.初筛找出282717个化合物的3维数据建成数据库，所有分子构建和对接计算模块均在方正文祥E520计算机上，使用SYBYL软件包完成，计算中使用的各项参数除非特别说明均采用缺省值.

1.2 流感病毒PB2亚基结构准备

从PDB数据库(http://www.rcsb.org)中搜索到流感病毒PB2的2种晶型[3]：4NCM和4P1U，下载它们的三维数据，保存为4NCM.pdb和4P1U.pdb.使用sybyl软件对流感病毒PB2蛋白晶体结构进行预处理，去掉边缘的水分子，加上氢原子，对蛋白质分子加载AMBER7 FF99电荷，并对原有小分子抑制剂加载Gasteiger-Hückel电荷，其中电荷类型与预处理一致.在晶体结构中提取原有小分子抑制剂的结构，用来确定对接位点.

1.3 配体小分子的虚拟筛选和分子对接

将数据库中的化合物分子作为配体，使用SYBYL SurFlex模块与PB2晶体结构进行对接，选择对接区域模式为ligand，以上文中提取出的4CNM-ligand.mol2为引导文件.点选generate生成探针文件，确定jobname为4NCM开始分子对接，将对接结果之一的打分图保存，并将打分靠前的3个化合物与4NCM结合的文件用Discovery Studio 4.1 Client打开，标示出活性位点的空间构象，受体与供体的连接作用方式，截图保存.

2 结果与讨论

2.1 配体小分子虚拟筛选结果

配体小分子虚拟筛选结果见图2.

2.2 分子对接分析

配体小分子AO-022/43453673与4NCM的对接结果见图3.由图3可见，该化合物分子内形成氢键，用于稳定分子构型.分子中苯环上的甲氧基与SER321上的羟基形成氢键，胍基上的氢与GLU361的氧形成氢键，嘧啶环与LYS376形成氢键.嘧啶环上的羟基同时与LYS376和PHE404形成氢键.此外，分子中的嘧啶环还与HIS357和PHE404存在π-π相互作用，苯环与PHE325存在π-π相互作用，进一步增加了小分子与蛋白质结合的稳定性.

图2 对接结果Fig.2 Docking results

配体小分子AN-655/14860175与4NCM的对接结果见图4.由图4可见，配体小分子与蛋白质晶体形成氢键而牢固地固定在腔体中，分子中的甲氧基与ASN429的氨基形成氢键.除氢键外，分子中的苯环、咪唑、四氢咪唑环与HIS357,PHE323和PH404中存在π-π相互作用，极大地增强了小分子的活性.此外，分子还与HIS357,PHE323和PHE404存在疏水作用力.

图3 配体小分子AO-022/43453673与4NCM的对接结果Fig.3 Docking result of small ligand molecule AO-022/43453673 and 4NCM

图4 配体小分子AN-655/14860175与4NCM的对接结果Fig.4 Docking result of small ligand molecule AN-655/14860175 and 4NCM

3 结语

结合本文虚拟分子对接实验结果与Michael P. Clark研究发现的化合物VX-787的结合情况可知：对接结果较好的小分子化合物的共同特征是含有多羟基和羰基，能与活性中心的多处氨基酸残基形成氢键，分子中的芳环或芳杂环多能与HIS357, PHE404, PHE323之间存在π-π相互作用，并被活性位点附近残基组成的疏水口袋包围，使化合物分子与活性中心结合更加紧密，抑制作用更强.侧链引入苯环等疏水基团能与活性中心的氨基酸残基形成较强的疏水作用力，这是化合物产生作用的关键.Zincs数据库编号为AO-022/43453673，AN-655/14860175等打分排名靠前的化合物均具备潜在的治疗流感病毒的能力，可作为抗流感病毒新药的小分子.