Box-Behnken Design响应面法结合遗传算法和直接搜索算法优化丹栀逍遥散的提取工艺Δ

苏本正，江波，崔宁，于宗渊

（山东省中医药研究院，济南 250014）

逍遥散出自《太平惠民和剂局方》，由白芍、当归、茯苓、白术、柴胡、薄荷、炙甘草等多味药材组合而成。明代薛己在此基础上加入牡丹皮和栀子，制成加味逍遥散，又名丹栀逍遥散，具有养血健脾、疏肝清热之功效，是调和肝脾的代表方剂[1]。

有研究表明，白芍中的芍药苷对模型大鼠脑缺血后的血脑屏障具有保护作用[2]，对肿瘤细胞的生长有一定抑制作用[3]，对肝脏具有保护作用[4]；牡丹皮中的丹皮酚具有抗肿瘤[5]、抗神经系统氧化应激损伤[6]、抗动脉粥样硬化[7]和改善血液循环[8]等作用；栀子中的栀子苷具有保肝利胆[9]、改善脑缺血[10]、调节血糖[11]和镇痛抗炎[12]等作用。由此可见，栀子苷、芍药苷和丹皮酚这3个成分与丹栀逍遥散养血健脾、疏肝清热的攻效相呼应，均为该方重要的活性成分。此外有研究表明，该方中栀子苷、芍药苷和丹皮酚含量均较高[13]。因此，本试验选择栀子苷、芍药苷和丹皮酚为指标成分。

响应面法可通过建立连续变量曲面模型，对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价，最终确定各因素的最优水平取值[14]。近年来，响应面法逐渐被用于中药提取条件的优化中。美国MathWorks公司发布的MATLAB遗传算法与直接搜索工具箱（GADS）是一系列函数的集合，可让用户在响应面法结果的基础上同时使用遗传算法[15-16]和直接搜索算法[17]来求解各种优化问题。

本试验以乙醇体积分数、提取时间和液料比为考察因素，以丹栀逍遥散中栀子苷、芍药苷和丹皮酚3个指标成分的综合评分为评价指标，先采用Box-Behnken Design（BBD）响应面法进行试验设计，建立数学模型并获得目标函数后，再结合遗传算法和直接搜索算法求解各因素的最优范围与最优取值，为该方的提取工艺优化提供参考。

1 材料

1.1 仪器

2695型高效液相色谱仪，包括2996二极管阵列检测器、Empower色谱工作站等（美国Waters公司）；TDL40B型低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；BP211D型电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；FW-80型高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）；KDM型控温电热套（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 试剂

1.3 药材

柴胡（批号：161201）、当归（批号：160501）、白芍（批号：160601）、白术（批号：160401）、茯苓（批号：161001）、炙甘草（批号：160601）、牡丹皮（批号：160801）、栀子（批号：160701）和薄荷（批号：160901）药材均购自山东百味堂中药饮片有限公司，经山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 栀子苷、芍药苷、丹皮酚的含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Phenomenex Luna-C18（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm（0～30 min）、232 nm（30～65 min）、274 nm（65～90 min）；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。在该色谱条件下，理论板数以栀子苷、芍药苷、丹皮酚峰计均大于3 000，分离良好，分离度均大于1.5。色谱见图1。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution procedure

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取指标成分对照品各适量，加甲醇制成栀子苷、芍药苷和丹皮酚质量浓度分别为74.9、56.2、33.4 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 分别精密称取柴胡0.5 g、当归0.5 g、白芍0.5 g、白术0.5 g、茯苓0.5 g、炙甘草0.4 g、牡丹皮0.75 g、栀子0.75 g和薄荷0.1 g（均粉碎，过4号筛）组成复方，加入一定量提取溶剂后，称定质量，加热回流提取；提取液滤过后放冷，用提取溶剂补足减失的质量，3 000 r/min离心15 min；取上清液1 mL，用提取溶剂定容至10 mL，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察 分别精密量取“2.1.2”项下混合对照品溶液0、1、2、4、6、8、10、20 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各指标成分进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得栀子苷、芍药苷、丹皮酚的回归方程分别为y＝1 483 728x－12 051（r＝0.999 5）、y＝927 308x－20 630（r＝0.997 5）、y＝5 116 603x－44 372（r＝0.999 9）。结果表明，栀子苷、芍药苷、丹皮酚检测进样量线性范围分别为0.074 9～1.498、0.056 2～1.124、0.033 4～0.668 μg。

2.1.5 方法学考察 分别进行精密度、稳定性、重复性试验，分别测定栀子苷、芍药苷和丹皮酚的峰面积。结果栀子苷、芍药苷和丹皮酚峰面积的RSD均小于3.0%，表明本试验仪器精密度、方法重复性均较好，供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

2.1.6 样品中各指标成分的含量测定及综合评分 取处方配比药材样品（均粉碎，过4号筛）各适量，分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算样品中各指标成分的含量。以各指标成分的最高含量值为参照将数据进行归一化，再按照各指标成分的权重（本研究将栀子苷、芍药苷和丹皮酚的权重系数均设为1）计算得综合评分：综合评分（Y）＝（栀子苷含量/栀子苷最高含量+芍药苷含量/芍药苷最高含量+丹皮酚含量/丹皮酚最高含量）。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数对综合评分的影响 在提取时间2 h、液料比15∶1（V/m，mL/g）、提取2次的条件下，分别设置乙醇体积分数为20%、40%、50%、60%、70%、80%。取处方配比药材样品（均粉碎，过4号筛）适量，分别进行加热回流提取，按“2.1.6”项下方法进行各指标成分含量测定并计算综合评分，结果见图2A。由图2A可知，综合评分随乙醇体积分数的增大而先增加后趋于平缓并略有降低，当乙醇体积分数为60%时样品综合评分最高，故最终选择60%乙醇为提取溶剂。

图2 单因素试验结果Fig 2 Results of single factor experiment

2.2.2 液料比对综合评分的影响 在60%乙醇为提取溶剂、提取时间为2 h、提取2次的条件下，分别设置液料比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、30∶1（V/m，mL/g）。取处方配比药材样品（均粉碎，过4号筛）适量，分别进行加热回流提取，按“2.1.6”项下方法进行各指标成分含量测定并计算综合评分，结果见图2B。由图2B可知，综合评分随液料比的增大而先增加后降低最后趋于平缓，当液料比为15∶1（mL/g）时综合评分最高，故最终选择15∶1（mL/g）为液料比。

摩擦纳米发电机等效电路模型研究……………………………………………………魏子钧，耿来鑫，边森 24-5-35

2.2.3 提取时间对综合评分的影响 在60%乙醇为提取溶剂、液料比为15∶1（V/m，mL/g）、提取2次的条件下，分别设置提取时间为1.5、2、2.5、3、4 h。取处方配比药材样品（均粉碎，过4号筛）适量，分别进行加热回流提取，按“2.1.6”项下方法进行各指标成分含量测定并计算综合评分，结果见图2C。由图2C可知，综合评分随提取时间的延长而先增加后降低，当提取时间为3 h时综合评分最高，故最终选择3 h为提取时间。

2.2.4 提取次数对综合评分的影响 在60%乙醇为提取溶剂、提取时间为2 h、液料比为15∶1（V/m，mL/g）的条件下，分别设置提取次数为1、2、3、4次。取处方配比药材样品（均粉碎，过4号筛）适量，分别进行加热回流提取，按“2.1.6”项下方法进行各指标成分含量测定并计算综合评分，结果见图2D。由图2D可知，综合评分随提取次数的增多而先增加后趋于平缓，当提取2次时综合评分已高于2.95分，故最终选择2次为提取次数。

2.3 BBD响应面法优化提取工艺

2.3.1 试验设计与结果 在单因素试验的基础上，运用Design-Expert 8.0.5b软件，以综合评分为响应值，以乙醇体积分数（A）、提取时间（B）和液料比（C，V/m）为因素，采用BBD响应面法进行3因素3水平试验。因素与水平见表2，BBD响应面试验设计与结果见表3。

表2 因素与水平Tab 2 Factors and levels

表3 BBD响应面试验设计与结果Tab 3 Design and results of BBD respone surface trial

2.3.2 模型拟合和方差分析 运用Design-Expert 8.0.5b软件对试验数据进行模型拟合，拟合得到的回归模型为Y＝－15.116 47+0.402 85A+2.266 67B+0.283 86C－0.002 425AB+0.001 12AC－0.016 20BC－0.003 391 75A2－0.300 17B2－0.009 597C2（r＝0.991）。对该模型进行方差分析，结果见表4。由表4可知，该模型的P＜0.000 1，说明模型具有显著性；失拟误差的P＝0.065 70.05，说明失拟项不具有显著性，即该模型对试验数据的拟合情况较好，可较好地分析各因素对丹栀逍遥散指标成分提取的影响。方差分析结果显示，模型中A、B、C、BC、A2、B2、C2对响应值影响显著，AB、AC影响不显著。经软件分析可得最优提取工艺条件为60.88%乙醇提取3.11 h、液料比15.72∶1（mL/g），在此条件下可得综合评分为2.895 24。

表4 方差分析结果Tab 4 Analysis results of variance

2.4 遗传算法求解最优提取工艺条件

以“2.3.2”项下拟合模型为目标函数，使用Matlab 2014b软件的GADS工具箱，采用遗传算法求解指标成分的最优提取工艺条件。遗传算法工具GUI参数设置见表5；随机搜索10次，结果见表6。由表6可知，10次随机搜索结果的变异范围较小，对目标函数最佳值的逼近程度较好。因此，取10次随机搜索的平均水平即60.872 000%乙醇提取3.105 564 h、液料比15.719 832∶1（mL/g），预测综合评分为2.895 433。

表5 遗传算法工具GUI参数设置Tab 5 GUI parameter setting of genetic algorithm tool

2.5 直接搜索算法求解最优提取工艺条件

以“2.3.2”项下拟合模型为目标函数，使用Matlab 2014b软件的GADS工具箱，采用直接搜索算法求解最优提取工艺条件。直接搜索算法工具GUI参数设置见表7；随机搜索10次，结果见图3。

表6 遗传算法搜索结果Tab 6 Search results of genetic algorithm tool

表7 直接搜索算法工具GUI参数设置Tab 7 GUI parameter setting of direct search method tool

由图3可知，10次随机搜索结果完全一致。即以60.871 948%乙醇提取3.105 560 h、液料比15.719 849∶1（mL/g），预测最优综合评分为2.895 433。

2.6 最优提取工艺的确定及工艺验证

根据实际情况，确定各因素结果的小数位数，得到BBD响应面法的提取工艺优化结果为60.88%乙醇提取3.1 h、液料比15.72∶1（mL/g）。经遗传算法和直接搜索算法优化的最优提取工艺条件与之相差不大，其共同优化结果为60.87%乙醇提取3.1 h、液料比15.72∶1（mL/g）。分别按照以上两种优化工艺条件进行验证试验，每种条件平行操作6次，并就综合评分进行统计学配对t检验。结果，两种工艺条件下的综合评分比较差异无统计学意义（t＝－0.851，P＝0.434＞0.05），且样品综合评分平均值为2.903，即采用BBD响应面法或结合遗传算法和直接搜索算法均可较好地对丹栀逍遥散中3个指标成分的提取工艺进行优化，且结果无显著性差异。

图3 直接搜索算法搜索结果Fig 3 Search results of direct search method pattern

3 讨论

BBD响应面法是一种条件寻优的试验设计方法，可将复杂的未知函数关系在小区域内用简单的模型来拟合，其计算简便，可减少试验次数、降低成本等，具有可连续对试验各水平进行分析的优势。遗传算法借鉴了生物界自然选择和自然遗传的机制，使原始数据在迭代过程中产生遗传和变异，并从全局的角度去寻找最优试验条件，可有效避免最优试验条件选取时的主观性和局部最优解问题。直接搜索算法可以作为上述优化方法的一个补充，其采用的是模式搜索方法，可搜索出最大、最小正基模式，处理边界约束、线性等式、线性不等式，并且不需要函数可微或连续。但是以上3种方法均存在局限性：BBD响应面法要求设计的试验点必须包括最优试验条件，因此需要对各因素进行尽量精确的控制；遗传算法和直接搜索算法均需事先获得相对准确的目标函数，进而对目标函数进行最小值精确寻优。因此，先采用BBD响应面法建立数学模型、获得目标函数后，再使用遗传算法或直接搜索算法搜索各因素的精确最优值，在优化中药提取工艺方面具有一定优越性。本试验以乙醇体积分数、提取时间和液料比为考察因素，以复方丹栀逍遥散中3种活性成分的综合评分为评价指标，采用BBD响应面法结合遗传算法和直接搜索算法求解各因素的最忧取值，可为复方丹栀逍遥散的提取工艺研究提供一定参考。