三棱、莪术提取物联合热疗对结肠癌SW620细胞凋亡及迁移、侵袭能力的影响Δ

王振兴，李水芹，赵梓亦，王飞

（1.成都中医药大学临床医学院，成都 610075；2.成都中医药大学附属医院脾胃病科，成都 610073）

腹膜转移癌（Peritoneal carcinomatosis，PC）是恶性肿瘤细胞经血管、淋巴管转移至腹膜腔后最常见的继发性腹膜肿瘤，也是恶性肿瘤晚期最常见的并发症[1]。其临床治疗难度大，患者中位生存期短、预后差[2-3]。目前临床上采用全身化疗、腹腔化疗和姑息性手术治疗PC的疗效不佳，而细胞减灭术联合腹腔热灌注化疗（IHPC）是提高PC治疗效果的主要措施[4]。IHPC是一种通过将恒温（42～45℃）的化疗药液灌注入腹腔的治疗方式，其在预防和治疗腹膜种植转移癌方面的作用已得到了国内外学者的广泛重视[5]。但是由于化疗药物价格昂贵且存在骨髓抑制等毒副作用，使其与IHPC的联合应用受到了很大限制[6]。

三棱、莪术是中药配伍中常用的破血化瘀药对[7]，《医学衷中参西录》载：“三棱气味俱淡，微有辛意；莪术味微苦，气微香，亦微有辛意；性皆微温，为化瘀血之要药。”本课题组在前期理论构建中将PC纳入中医学“癌毒”的范畴，并指出癌毒阻络、气滞血瘀是其主要病机[8-9]；在前期的临床观察中发现三棱、莪术组分配伍联合IHPC治疗恶性肿瘤晚期癌性腹水具有显著的疗效，且比单纯化疗药物治疗对患者的毒副作用更小。据此，本课题组认为将三棱、莪术组分联合IHPC用于PC可能具有较好的临床效果和较小的副作用。本课题组通过预实验考察了三棱、莪术提取物联合热疗对结肠癌细胞作用不同时间（0、6、12、24、48 h）的效果，发现其对肿瘤细胞的杀伤作用以作用24 h时为最强。因此，本研究选择易发生腹膜转移的结肠癌SW620细胞为对象，考察三棱、莪术提取物联合热疗作用24 h时对肿瘤细胞凋亡及迁移、侵袭能力的影响，为该疗法临床用于治疗PC提供实验基础。

1 材料

1.1 仪器

3100型CO2培养箱（美国Fisher Scientific公司）；3-18K型冷冻离心机（美国Sigma公司）；X71型荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；Ⅱ型多功能酶联免疫检测仪（美国BioTek公司）；Navios流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）；2C型精密电子天平（常州市幸运电子设备有限公司）。

1.2 药品与试剂

三棱免煎颗粒、莪术免煎颗粒[四川新绿色药业科技发展股份有限公司；两种免煎颗粒分别为采用三棱（批号：4301730）、莪术（批号：1362172）药材提取物制备所得的同批次制剂]；Matrigel基质胶、AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒（美国BD公司）；DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）、碘化丙啶（PI）、MTT试剂、二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）；胎牛血清、pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）（美国Gibco公司）；其他试剂均为分析纯，水为去离子水。

1.3 细胞

结肠癌SW620细胞株购自American Type Culture Collection公司（编号：CLL-227），冻存于成都中医药大学附属医院中心实验室。细胞以37℃温水复苏后，用含有10%胎牛血清、1%青-链霉素的DMEM培养基在37℃、5%CO2培养箱中长期培养。

2 方法

2.1 三棱、莪术提取物的细胞毒性考察

采用MTT法测定药物的细胞毒性。取对数生长期的SW620细胞，用DMEM培养基（以下简称“培养基”）调整细胞浓度至5×106个/mL，以每孔100 μL接种于96孔板，在37℃、5%CO2条件下培养24 h。取三棱免煎颗粒，用PBS溶解制成相应质量浓度的药液，按1.25、2.5、5、7.5、10 μg/mL加入各细胞孔；取莪术免煎颗粒，用PBS溶解制成相应质量浓度的药液，按5、10、15、20、25 μg/mL加入各细胞孔；同时设置未经过药物处理的空白组。各组细胞在37℃、5%CO2条件下培养24 h后，于显微镜下观察细胞状态；弃去培养基，每孔加入PBS 100 μL、5 mg/mL MTT溶液20 μL，继续在37 ℃、5%CO2条件下培养4 h；弃去培养基，每孔加入DMSO 150 μL，充分震荡至结晶物完全溶解。采用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定吸光度（A），计算药物对SW620细胞的抑制率[抑制率＝（1－A加药组/A空白组）×100%]；同时，绘制细胞增殖抑制曲线，求算30%细胞生长抑制浓度（IC30）、50%细胞生长抑制浓度（IC50）。

2.2 三棱、莪术提取物联合热疗对细胞死亡情况的影响考察

采用CFSE/PI双荧光染色法考察细胞死亡情况。取对数生长期、融合度为50%～80%的SW620细胞，分为空白对照组（不作热疗处理，不加药）、IC50三棱提取物组、IC50三棱提取物+热疗组、IC50莪术提取物组、IC50莪术提取物+热疗组。其中IC50三棱提取物+热疗组、IC50莪术提取物+热疗组细胞先在42℃条件下放置90 min进行热疗处理。将经过热疗处理或未经热疗处理的各组细胞接种于12孔板（5×105个/孔），在37℃、5%CO2条件下培养24 h使细胞贴壁。然后加入5 μmol/L CFSE染色液，在37℃、5%CO2条件下培养30 min；弃去培养基，按不同分组加入新鲜培养基或含有相应药物（三棱提取物为4.69 μg/mL，莪术提取物为16.81 μg/mL）的新鲜培养基，继续培养24～48 h；弃去培养基，加入10 μg/mL PI-PBS染色液2 mL，于37℃、5%CO2条件下培养10 min；PBS冲洗细胞5 min×3次。每组设置3个复孔。采用荧光倒置显微镜观察细胞死亡情况（绿色荧光阳性/红色荧光阴性者为活细胞，绿色荧光阳性/红色荧光阳性者为死细胞）。

2.3 三棱、莪术提取物联合热疗对细胞凋亡率的影响考察

为进一步确认三棱、莪术提取物联合热疗对细胞凋亡的影响，采用FITC标记的AnnexinⅤ试剂和PI试剂对SW620细胞进行双染色，并通过流式细胞术分析细胞凋亡情况。按“2.2”项下方法分组并进行热疗处理和给药，每组设置3个复孔。然后用0.25%胰蛋白酶消化处理后的细胞，制备单细胞悬液，以PBS调整细胞终浓度至1×106个/mL。然后加入AnnexinⅤ-FITC 试剂20 μL和PI试剂5 μL进行双染色，轻柔混匀，室温下避光反应15 min，再加入PBS 300 μL，立即采用流式细胞仪进行检测。

2.4 三棱、莪术提取物联合热疗对细胞迁移能力的影响考察

采用划痕实验考察细胞迁移能力。用记号笔在6孔板的背面均匀划横线，各3条。取对数生长期SW620细胞接种于孔内（1×106个/孔），在37 ℃、5%CO2条件下培养过夜，至次日细胞铺满板底。将细胞分为空白对照组（不作热疗处理，不加药）、IC30三棱提取物组、IC30三棱提取物+热疗组、IC30莪术提取物组、IC30莪术提取物+热疗组，按“2.2”项下方法进行热疗处理和给药（三棱提取物为3.24 μg/mL，莪术提取物为11.27 μg/mL），每组设置3个复孔。用微量移液枪头进行划痕，划痕尽量与记号笔横线垂直，不能倾斜；用PBS冲洗细胞3次，去除划痕后漂浮的细胞；然后在每孔中加入含1%胎牛血清的培养基2 mL，37℃、5%CO2条件下培养24 h。在倒置显微镜下随机选择5个独立视野观察划痕愈合情况。

2.5 三棱、莪术提取物联合热疗对细胞侵袭能力的影响考察

采用Transwell侵袭实验考察细胞侵袭能力。取－80℃下保存的Matrigel基质胶于4℃过夜解冻。取培养基与Matrigel基质胶按5∶1体积比混匀后，分别取100 μL加入各个Transwell小室，于37℃下放置至凝固。取对数生长期SW620细胞，用0.25%胰蛋白酶消化液悬浮，用PBS调整细胞浓度至1×106个/mL，然后取100 μL轻柔加入Transwell小室上层；在下室中加入含10%胎牛血清的培养基500 μL。按“2.4”项下方法分组并进行热疗处理和给药，每组设置3个复孔。各组细胞在37℃、5%CO2条件下培养24 h后，以PBS清洗Transwell小室3次，以5%戊二醛溶液固定，4℃下放置10 min。加入0.1%结晶紫溶液，室温下染色30 min，以PBS冲洗Transwell小室，并用棉球擦去表面细胞。在倒置显微镜下观察，并随机选择5个独立视野计算阳性染色细胞数。

2.6 统计学方法

数据采用SPSS 23.0统计软件进行处理。计量资料以x±s表示，组间比较采用配对t检验；计数资料使用χ2检验进行组间比较，用Fisher确切概率法进行双向检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 三棱、莪术提取物的细胞毒性

结果显示，随着三棱、莪术提取物质量浓度的增加，其对SW620细胞的抑制率也相应升高。不同质量浓度三棱、莪术提取物作用后的细胞增殖抑制曲线见图1。根据该曲线求算得三棱提取物IC30为3.24 μg/mL，IC50为4.69 μg/mL；莪术提取物IC30为11.27 μg/mL，IC50为16.81 μg/mL。

图1 不同质量浓度三棱、莪术提取物作用后的细胞增殖抑制曲线Fig 1 Cell proliferation inhibition curve after treated with different concentrations of S.stoloni extract or C.zedoaria extract

3.2 三棱、莪术提取物联合热疗对细胞死亡情况的影响

结果显示，与IC50三棱提取物组或IC50莪术提取物组比较，IC50三棱提取物+热疗组或IC50莪术提取物+热疗组的死亡细胞显著增多，且在明场条件下可见其细胞皱缩更明显，表明细胞存活状态更差。各组细胞CFSE/PI双荧光染色显微图见图2。

图2 各组细胞CFSE/PI双荧光染色显微图（×40）Fig 2CFSE/PI double fluorescent staining microgram of cells in each group（×40）

3.3 三棱、莪术提取物联合热疗对细胞凋亡率的影响

结果显示，IC50三棱提取物组细胞的凋亡早期率为0.3%、凋亡中晚期率为1.4%、坏死率为5.2%，IC50三棱提取物+热疗组细胞的凋亡早期率为0.9%、凋亡中晚期率为3.8%、坏死率为12.6%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；IC50莪术提取物组细胞的凋亡早期率为7.8%、凋亡中晚期率为4.4%、坏死率为2.0%，IC50莪术提取物+热疗组细胞的凋亡早期率为1.3%、凋亡中晚期率为4.4%、坏死率为16.2%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。这表明三棱、莪术提取物联合热疗可明显提高SW620细胞的凋亡率。各组细胞Annexin V/PI双染色流式细胞图见图3。

3.4 三棱、莪术提取物联合热疗对细胞迁移能力的影响

结果显示，与0 h比较，空白对照组细胞在24 h时的划痕愈合间距明显变窄，而IC30三棱提取物组、IC30三棱提取物+热疗组、IC30莪术提取物组、IC30莪术提取物+热疗组细胞在24 h时的划痕愈合间距未见明显变窄。各组细胞划痕实验显微图见图4。

3.5 三棱、莪术提取物联合热疗对细胞侵袭能力的影响

图3 各组细胞AnnexinⅤ/PI双染色流式细胞图Fig 3 AnnexinⅤ/PI double staining flow cytometry of cells in each group

结果显示，与空白对照组比较，IC30三棱提取物组、IC30三棱提取物+热疗组、IC30莪术提取物组、IC30莪术提取物+热疗组在24 h时跨膜细胞数均显著减少，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与IC30三棱提取物组或IC30莪术提取物组比较，IC30三棱提取物+热疗组或IC30莪术提取物+热疗组在24 h时跨膜细胞数均显著减 少，差异均有统计学意义（P＜0.05），表明热疗加强了药物对SW620细胞侵袭能力的抑制作用。其中，IC30三棱提取物+热疗组跨膜细胞数从IC30三棱提取物组的（152±23）个/视野减少至（31±6）个/视野，IC30莪术提取物+热疗组跨膜细胞数从IC30莪术提取物组的（189±41）个/视野减少至（67±15）个/视野。各组细胞Transwell侵袭实验显微图见图5，跨膜细胞数柱形图见图6。

图4 各组细胞划痕实验显微图（×40）Fig 4Microgram of cell scratch test in each group（×40）

图5 各组细胞Transwell侵袭实验显微图（结晶紫染色，×100）Fig 5 Microgram of Transwell invasion test in each group（crystal violet staining，×100）

图6 各组跨膜细胞数柱形图Fig 6 Columnar graph of the number of transmembrane cells in each group

4 讨论

IHPC是近年兴起的一种腹腔恶性肿瘤治疗手段，对各种腹腔恶性肿瘤的腹膜转移均具有可靠的临床疗效[10]。IHPC通过持续高温作用（42～43℃条件下作用90 min），能在不影响正常组织的情况下诱导肿瘤细胞凋亡；同时高温（＞41℃）可提高化疗药物进入肿瘤细胞的效率来达到更佳的肿瘤抑制效果[11]。

三棱、莪术是具有破血祛瘀、行气止痛功效的常用药对[7]，具有悠久的中医临床应用历史，是历代医家治疗症瘕积聚的常用药物[12]。著名医家王好古在《汤液本草》中曾言：“三棱，破血中之气，肝经血分药也。三棱、莪术治积块疮硬者，乃坚者削之也。”除了传统中医应用，三棱、莪术近年来在临床抗肿瘤治疗方面的应用也日趋广泛，包括用于宫颈癌[13]、肺癌[14]、胃癌[15]、白血病[16]等的治疗。三棱、莪术配伍后具有抗血栓、改善血液流变学、抗肿瘤、抗纤维化、增强免疫力等药理作用[17-20]。

本研究主要考察三棱、莪术提取物分别联合热疗对结肠癌SW620细胞凋亡及迁移、侵袭能力的影响，结果发现相对于三棱提取物组或莪术提取物组，三棱提取物+热疗组或莪术提取物+热疗组的细胞死亡数量增加、凋亡率显著升高，细胞的迁移和侵袭能力显著减弱。由此可见，联用热疗能够明显增强三棱或莪术提取物对SW620细胞的杀伤作用以及对其迁移和侵袭能力的抑制作用。本课题组下一步考虑将三棱、莪术的有效成分进行配伍并与热疗联用于SW620细胞，并选用更高热疗温度以增强对肿瘤细胞的杀伤作用，同时进一步探索该疗法联合中药用于治疗PC等肿瘤的分子生物学机制。