土家族药三百棒的HPLC指纹图谱研究Δ

文德鉴，丁慧云，斯琴，尹衡，涂星，2，袁丽君，袁林

（1.湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000；2.风湿病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000；3.湖北民族学院附属民大医院，湖北 恩施 445000）

三百棒为芸香科植物飞龙掌血[Toddalia asiatica（Linn）Lam.]的干燥根或根皮，始载于《植物名实图考》，又名见血飞、大救驾等，味微苦、辛，性温，具有祛风止痛、散瘀止血、消肿解毒的功效，临床多用于风湿痹痛、胃痛、跌打损伤、吐血、外伤出血、痛经、闭经、牙龈出血、口舌生疮等症的治疗[1-2]，为土家族治疗类风湿关节炎的习用药物。研究显示，三百棒主要含生物碱类、香豆素类、黄酮类和三萜类化合物，具有镇痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抗心肌缺血、改善毛细血管通透性等作用[3-6]。三百棒多产于秦岭南坡以南各地，最北见于陕西西乡县，在长江流域以湖北恩施、宜昌等地分布较多。由于土家族医药尚未形成体系，多以口耳相传的形式传授，导致三百棒名称众多、品种混乱，因此，有必要建立统一的质量标准。

中药指纹图谱是一种基于中药化学成分信息的综合的、可量化的鉴别手段，目前已成为国际公认最有效的控制天然药物及相关制剂质量的方法。中药指纹图谱根据其测定时采用的分析手段不同可分为中药化学指纹图谱和中药生物指纹图谱，前者又可分为中药光谱指纹图谱、中药色谱指纹图谱、中药波谱指纹图谱以及多种现代分析仪器联用得到的多维多息指纹图谱等[7-9]。而高效液相色谱（HPLC）指纹图谱属于中药色谱指纹图谱，是一门涉及分析化学和计算机科学的跨学科技术，其以中药的传统形态学鉴定为依据，以重视药味协同作用的中药理论为指导，在确定中药化学成分的基础上，以中药各有效成分的整体组成来评价中药质量，目前在中药材及中成药的质量控制及真伪优劣鉴别上得到了广泛的应用[10-13]。

本研究旨在通过HPLC指纹图谱法，对湖北恩施9个不同产地的三百棒药材进行质量分析，通过指纹图谱相似度评价，综合比较不同产地药材之间的差异，为制定全面的三百棒药材质量控制方法提供依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-2030C型HPLC仪，含二极管阵列检测器、四元梯度高压输液系统、自动进样系统（日本Shimadzu公司）；BT25S型十万分之一电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；VX-200型旋涡混合器（美国Labnet公司）；Milli-Q型超纯水系统（美国Millipore公司）；KQ2200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；R-210型旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；TESTO-511型便携式绝压表（德国Testo公司）。

1.2 试剂

岩白菜素对照品（批号：111532-201604，纯度：94.1%）、毛两面针素对照品（批号：111718-201402，纯度：＞98%）均购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为去离子超纯水。

1.3 药材

三百棒对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121410-200701）；9批三百棒药材采集于恩施9个不同产地（见表1），经湖北民族学院医学院朱敏英副教授鉴定为真品。

表1 三百棒药材来源Tab 1 Sources of T.asiatica

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：SinoChrom ODS-BP（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.75%冰醋酸溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表2）；流速：1.0 mL/min；检测波长：275 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL[14]。

表2 梯度洗脱程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取岩白菜素对照品10 mg、毛两面针素对照品5 mg，置于同一10 mL量瓶中，加80%甲醇溶解并定容，得岩白菜素、毛两面针素质量浓度分别为1 000、500 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取药材样品粉末（过2号筛）适量，精密称取0.5 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入80%甲醇50 mL，称定质量，50℃下超声提取（功率：300 W，频率：100 kHz）60 min；放冷至室温，再次称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S2）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次。以岩白菜素峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，14个共有峰相对保留时间的RSD均小于1%（n＝6），相对峰面积的RSD均小于4%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S2）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24、48 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定。以岩白菜素峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，14个共有峰相对保留时间的RSD均小于3%（n＝7），相对峰面积的RSD均小于4%（n＝7），表明供试品溶液在室温下放置48 h内基本稳定。

2.3.3 重复性试验 精密称取药材样品（编号：S2）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定。以岩白菜素峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，14个共有峰相对保留时间的RSD均小于3%（n＝6），相对峰面积的RSD均小于4%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.4 HPLC指纹图谱的生成与相似度评价、共有峰相关分析

2.4.1 HPLC指纹图谱的生成 取10批药材样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》对10批药材样品的HPLC图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1、图2。

2.4.2 相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》，以S1为对照，进行整体相似度评价。结果显示，10批药材样品中，有4批相似度均大于0.90，详见表3。

2.4.3 共有峰的指认及相关分析 10批药材样品有14个共有峰，通过与对照品比对，指认3号峰对应成分为岩白菜素，12号峰对应成分为毛两面针素。由于3号峰响应值更加稳定、分离更好，故设定为参照峰，以此峰计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，详见表4、表5。

3 讨论

图1 10批药材样品的HPLC叠加指纹图谱Fig 1 HPLC superimposed fingerprint of 10 batches of samples

图2 药材样品的HPLC对照指纹图谱Fig 2 HPLC control fingerprint of samples

表3 10批药材样品相似度评价结果Tab 3 Similarity evaluation of 10 batches of samples

笔者通过预试验比较了分别以乙腈-0.05%磷酸溶液[15]、乙腈-0.1%磷酸溶液[16-17]、乙腈-0.75%冰醋酸溶液[18]作为流动相时对色谱图的影响，发现以乙腈-0.75%冰醋酸溶液作为流动相进行梯度洗脱时获得的色谱峰尖锐、基线漂移较小、分离度良好，且色谱峰信息丰富。故选择乙腈-0.75%冰醋酸溶液作为流动相。笔者还比较了221、230、254、275、300、330、365 nm各检测波长下获得的色谱图，发现在275 nm波长下获得的色谱峰分离度良好、信息丰富，指纹图谱的整体特征较稳定。故选择275 nm作为检测波长。

表4 10批药材样品HPLC图谱共有峰的相对保留时间Tab 4 Relative retention time of common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of samples

表5 10批药材样品HPLC图谱共有峰的相对峰面积Tab 5 Relative peak area of common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of samples

通过预试验，笔者比较了分别以体积分数为100%、95%、80%、60%的乙醇和体积分数为100%、80%、60%的甲醇作溶剂提取药材样品粉末后所获得的色谱图，结果发现以80%甲醇作提取溶剂时获得的色谱峰数目较多、峰面积较大；以乙醇提取时色谱峰数目虽然较多，但峰面积偏小；而当提取溶剂中水的比例过大时获得的色谱峰较为杂乱、分离度较低。故选择80%甲醇作提取溶剂。笔者还以对照药材为研究对象，比较了超声提取30、60、90 min时对色谱图的影响，结果发现提取60 min和90 min时所测得的岩白菜素和毛两面针素的峰面积无显著性差异，且均显著高于提取30 min时。出于节能考虑，选择超声提取时间为60 min。

本研究通过对恩施9个不同产地的三百棒药材样品的HPLC指纹图谱研究，发现有14个共有峰；利川市建南镇、利川市团堡镇、恩施市鹤峰县燕子乡、恩施市巴东县野三关镇所产的药材样品与对照药材比较相似度均大于0.90，其余产地药材样品相似度均小于0.90。结果表明，利川市建南镇、利川市团堡镇、恩施市鹤峰县燕子乡、恩施市巴东县野三关镇所产三百棒药材质量相对较佳。而该4个产地均处于较高海拔地区，三百棒药材质量是否与其产地的海拔高度有关还有待进一步研究。

综上所述，本研究所建HPLC指纹图谱可为三百棒药材质量控制提供依据。