浅谈目前猪非洲猪瘟病毒的常用诊断方法

尹训强

（广东温氏大华农生物科技有限公司，广东 云浮 527400）

距我国首次报道非洲猪瘟病毒（ASFV）感染病例已经一周年了，一年内该病毒几乎肆虐了国土全境，随之造成了生猪存栏量锐减、猪肉价格发生猛涨的情况。近期候选疫苗出现、非洲猪瘟弱毒疫苗专利申请成功，据报道中国有关权威部门公布的首例非洲猪瘟流行毒株（SY18）为亲本构建的多基因家族（MGF）基因和CD2v 基因缺失的非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗候选株[1]和中国流行非洲猪瘟毒株Pig/CN/HLJ/2018 缺失的MGF360-505R 缺失和CD2v 与MGF360-505R 联合缺失的基因缺失病毒[2]，均显示出可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟的疫苗的卓越潜能，具有极大的社会价值和国际意义。仅靠扑杀等成本巨大的非洲猪瘟净化手段，不符合我国生猪饲养量巨大的国情，借鉴已有的多种病毒病共存的防控经验，研制出有效、安全的防控非洲猪瘟疫苗是目前最为有效和经济的方法。随着非洲猪瘟流行病学、相关致病机制、防治疫苗研发、检测手段等相关领域研究工作的加快，以及未来中国生猪养殖常态化免疫非洲猪瘟疫苗的极大可能，针对非洲猪瘟病毒的临床诊断技术和快速诊断检测技术产品的使用，始终会伴随着各个防控非洲猪瘟和生猪养殖的各个环节。

1 临床早期表现及诊断

基层兽医的专业性水平决定着临床早期诊断ASFV 的成败，兽医从业者面对该病更要在诊断环节中加强学习和总结，进而不断提高对该病的临床诊断技术。

1.1 三种毒力类型ASFV 在临床上的不同表现[3]

不同类型的ASFV 的主要临床表现和剖检病变的指标包括以下方面：精神状态、体征变化、凝血不良的现象、皮肤、淋巴结、心、肝、脾、肺、肾、胆囊、扁桃体、繁殖性能变化等。

强毒株可引起最急性型（感染后1 ～4 d 死亡）和急性型（感染后3 ～8 d 死亡）临床表现。发病猪体温可达41 ～42 ℃，呕吐、血便、食欲废绝、精神沉郁、呼吸困难，皮肤充血变红或变蓝色，猪只有时无征兆发生猝死，发病率和死亡率可达100%。

中等毒力毒株可引起感染20 d后死亡的亚急性型表现，死亡率略低，打针流血不止。主要症状是比急性型更为强烈的出血和水肿，死亡率为30% ～70%。耐过猪约3 ～4周后康复后成为带毒猪。

强毒力、中等毒力毒株是以发热和网状内皮组织出血为特征[4]，均可使妊娠母猪流产，胎儿全身水肿，胎盘、皮肤、心肌或肝脏可见淤血点。

低毒力毒株引起慢性型的特征是病猪无出血表现，耳部、腹部和大腿内侧等部位皮肤可见坏死、局部红斑或凸起，康复后成为病毒携带者。

1.2 病理变化

最急性型发病猪急性死亡，其内脏组织器官的肉眼病变不明显。

急性型病猪，脾充血性肿大约3 ～6 倍，边缘肿胀、质脆、外观黑紫色；胃、肝和肾等部位的淋巴结出血、肿大，质地变脆；肾脏皮质和肾盂通常出现瘀血点。病猪因肺水肿严重而死亡；胃底部淤血，胆囊充盈。其他非典型病理变化还包括膀胱、心内膜、心外膜和胸膜有出血点。发生腹泻或血便的病猪可见出血性肠炎。

亚急性型猪只呈现腹水、心包积液、胆囊和胆管壁的特征性水肿以及肾周边水肿。脾脏起初表现为出血性肿大，逐渐转归；淋巴结呈现出血、水肿和易碎，呈现为深红色血肿，主要是在胃和肾的淋巴结，以及颌下腺、咽后、纵膈、肠系膜和腹股沟淋巴结。肾脏（皮质、髓质和肾盂）出血比急性型更严重和广泛。

慢性非洲猪瘟的病变特点表现为肺部局部肉芽肿，形成结节或肺脏肉样实变、纤维素性胸膜炎、干酪样肺炎和淋巴网状组织增生；也常见纤维素性心包炎和坏死性皮肤病变；扁桃体和舌上可见坏死。

2 实验室诊断方法

2.1 病原学诊断

聚合酶链式反应（PCR）分为普通PCR 和实时荧光定量PCR 两种。目前学术界研究的PCR 引物一般都是以靶向病毒基因组高度保守区域P72（P73）、P54 等蛋白基因[5-7] 设计，具有较高特异性和敏感性，适合各类ASFV 毒株的检测。

世界动物卫生组织（OIE）推荐采用PCR 和实时荧光定量PCR方法，可以直接从采样组织和体液中检测病毒，具有良好的特异性[8]。相对来讲，直接免疫荧光试验主要用于检测实质脏器（脾脏、肺脏、淋巴结和肾脏）等组织触片或冷冻切片中的病毒抗原，该方法快速、经济和敏感性高，但对于非洲猪瘟的亚急性或慢性病例，若组织中已形成了抗原- 抗体复合物，那么该方法的敏感性会下降到40% ；血细胞吸附试验的原理是，红细胞能吸附在体外培养的感染ASFV 的巨噬细胞膜表面，因此，将病料组织感染巨噬细胞后，红细胞如果在巨噬细胞周围形成典型的玫瑰花环，则证明该病料组织中含有ASFV。该方法特异性和敏感性均较高，但有些非洲猪瘟病毒毒株能迅速诱导巨噬细胞产生细胞病变，而不出现血细胞吸附现象。

此外，也有人采用非结构蛋白DNA 聚合酶G1211R 基因的实时荧光环介导等温扩增（LAMP）方法，用于大量样品的快速检测。研发ASFV 荧光PCR 检测试剂盒，可以避免由于操作环境、试剂不同和人为操作水平参差不齐等原因而影响该方法对ASFV 的检测效果。

2.2 血清学诊断

检测抗体可用于ASFV 感染猪的诊断，目前常用的有间接免疫荧光试验（IFA）、间接酶联免疫吸附试验（ELISA）等，并且OIE 将ELISA 作为诊断ASFV 的首选血清型方法。最急性和急性病例的猪死亡率高，通常血清抗体转阳前即会死亡。亚急性病猪耐过或康复后可产生高水平的ASFV 特异性抗体。一般病毒感染后4 d 可产生IgM 抗体，感染后6 ～8 d 产生IgG 抗体。抗体与ASFV 可同时存在于感染猪血液，大约持续6 个月，有时病毒可存在数年。

ELISA 检测法是一种灵敏的、廉价的方法，可大批量检测血清。但该法不足之处就是常有假阴性或假阳性结果的出现，这主要是因血清的保存不当及缺少特异性抗体而引起的[9]。

3 讨论

3.1 对ASF 的临床诊断必须及时和准确

“早、快、严、小” 是传染病处理原则，要求基层防疫过程中，对病原体要早排查、早发现、早上报、早诊断！只有及时诊断出来结果，才会避免大面积污染环境，然后立即采样、上报、必须在国家指定的实验室检测疑似病猪。

与ASFV 感染相关的临床特征具有高度的可变性，这取决于多种因素：病毒致病力、猪的品种、暴露途径、感染剂量和该地区的非洲猪瘟流行状况。因为国内研究条件要求的严格性、基层猪场总结临床症状的专业性缺乏等原因，造成很少报道中国猪场感染病毒及病毒致病能力大小的文章，从而对本国毒株及其致病性能的研究缺乏临床详细的资料。

目前已发现，在疫病流行区（在中、强毒株传播的同时）存在低毒力的毒株，非洲猪瘟潜伏期可达4 ～19 d，如此较长的潜伏期可以带来很大的影响，对于国际上广泛采用的早期定点精准清除病猪措施来讲，直接决定了其成功与否和是否能干净处理。也是追溯感染最初时间的重要依据。

病理剖检一般不建议进行，哪怕是疑似。因为猪场在解剖过程中，出现任何不严密的操作和处理措施，很容易造成ASFV 的散播，进而加重了生物安全防控工作。

ASFV 对于猪瘟、猪丹毒、猪繁殖与呼吸综合征、猪皮炎肾病综合征、中毒等病的鉴别诊断也同样重要，惊恐之下，没有诊断经验的兽医往往误诊，造成的众多无辜病猪被人为地扑杀！要借助流行病学特征进行排除，如是否使用餐厨废弃物饲喂猪、与售猪商贩接触、引入了来自疫区的感染猪、接触了来自疫区的相关人员及猪肉制品等。在非洲猪瘟和其他病没有出现明显区别的临床症状之前，最终还是要以权威实验室的确诊结果为主。

3.2 实验室诊断方法是最有效的手段

实验室诊断方法是目前对于研究非洲猪瘟病毒相关生化指标数据的最有效的手段。

目前非洲猪瘟病毒格鲁吉亚2007/1 毒株对家猪传播的动力学机理的研究发现，通过病毒滴定法和实时定量PCR(qPCR) 法检测ASF病毒，利用血清学试验测定ASF 病毒特异性抗体，试验结果显示，接种感染猪第3 天可在其血液中分离到有传染性的ASF 病毒，而通过直接接触和间接接触进行感染的猪分别在暴露后第10 天和第13 天方可从血液中分离到有传染性的ASF 病毒，ASF 临床症状发生时，ASF 病毒在血液中的滴度高于在鼻液和肠液中的，口液样本中没有分离到有传染性的ASF 病毒而检测到了其病毒的基因组[10]。

3.3 唾液检测对前期检测的研究价值

通过采集健康、 疑似、 患病猪只的唾液，对检测ASFV 的敏感性、可靠性的研究，褒贬不一，还有待深入。有人研究得出，唾液及鼻腔黏液比血液中病毒检出时间提早2~5 d，直肠黏液比血液中病毒检出的时间虽然滞后，但其病毒载量更高，血液中病毒载量是唾液中病毒载量的1 万倍，唾液比血液中病毒检出时间提早3 d 以上。对检测方法的灵敏度要求较高，唾液中含有DNA 酶和蛋白酶，可降解核酸的蛋白和DNA 的含量、不及时冷冻或运输中解冻，核酸均可被降解，因此唾液采集的方法的规范性很重要。相对而言，鼻腔黏液受到的干扰因素较小。精液中也存在着影响PCR 反应的因素，需使用柱提法提取核酸。

另外，采集的病料的风险因素的评估要求，唾液收集过程中，要避免病毒的扩散。

3.4 实验室诊断要求采样和实验室操作程序要准确。

病毒感染潜伏期往往在组织和体液中是不一样的，ASFV 往往先攻击的是巨噬细胞和单核细胞，此时扁桃体、唾液中可能会率先呈现出大量的病毒复制，所以前期采样需要把重点放在这里。采样往往因为这些环节微小的错误，就会影响有效检出病毒量的结果。

核酸的快速的有效提取，很大程度上影响着检测时间的长度。目前利用裂解酶免提取方法，大大节约了提取时间，可以在15 ～35 min内完成检测。

另外，提取核酸或者扩增产物等过程中，操作不当造成DNA 气溶胶污染整个实验室环境，往往使得检测结果一直是阳性，这个时候就要借助一些生物试剂或者物理措施进行反复处理，确保解除污染后再进行正常操作。

3.5 ASFV 检测试剂盒的行业质量标准，仍需要进行大量后期工作。

按照国家药品监督管理局第35号令《新生物制品审批办法》的有关要求，对产品进行长期的稳定性考核，考察最敏感质量指标（最低检出量和重复性），考核时间以产品的保质期时间跨度为标准。在 “以科学研究为基础、质量监控体系为保障” 的前提下，国家已经公布了研发生产出的一批高质量的ASFV荧光PCR 检测试剂盒，实现了快速定量检测。随着越来越多检测试剂盒的诞生，一定要建立试剂盒质量要求和监控体系，即针对合成的引物、探针、阴阳性对照品等部分，建立完善的质量检验方法，保证试剂盒使用质量，更好地服务兽医诊断工作。