余 刚,刘自逵,,4*,张运强,刘辉旺
(1.湖南农业大学动物医学院,湖南 长沙 410128;2 湖南加农正和生物技术有限公司,湖南 浏阳 410329;3.湖南省兽药工程技术研究中心,湖南 长沙 410128;4.北京精免大观生物科技研究院有限公司,北京 100096)
临床上可观察到患非洲猪瘟的猪会发生特大的败血脾、肝脏的脂肪变性、大叶性肺炎,胸腔与腹腔积液、红染,淋巴结特别是颈部淋巴结变黑、出血,全身广泛性出血与炎症等。
ASF 是直接接触性、恶性传染病,不接触无传染。非洲猪瘟病毒(ASFV)为非洲猪瘟属的唯一成员、唯一的虫媒DNA 双股螺旋病毒,其本身缺乏核蛋白体、线粒体、代谢酶系统和能量等,病毒自身不能在环境中增殖,必须侵入宿主的细胞才能进行复制,用PCR 检测出核酸阳性猪只并不一定具有感染性。2018 年8 月3 日我国首次报道,后确定其毒株为格鲁吉亚Ⅱ型强毒株,它传染性低但致死率非常高,初次感染可达100%,随着时间的推移病毒毒力有下降的趋势,目前在广东省发生的非洲猪瘟的情况,致死率没有100%,有一部分猪会存活下来,但在广西发生的情况有所区别,其致死率还能达到100%。
鼻腔和口腔是主要的感染门户,消化道和呼吸道黏膜的完整以及共同黏膜免疫屏障对防控非洲猪瘟是有帮助的。有人做了一个试验,通过口腔注射102HAD50(半数红细胞吸附量)病毒量猪只不感染,但鼻腔注射102HAD50则出现显著感染现象,说明经鼻感染比经口感染要容易得多;还有人验证,在饲料中的最小感染量为104TCID50(半数组织培养感染量),而在水中的最小感染量只为100TCID50,说明该病毒喜欢潮湿的环境,干燥对防控非洲猪瘟是非常有效的,而要通过饲料途径感染非洲猪瘟的可能性比较小,是安全的。
非洲猪瘟病毒首先感染咽峡的扁桃体并刺激产生抗体,并建立起病毒复制点(ASFV 主要在宿主单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等中复制,借助巨噬细胞的内吞作用而入侵宿主细胞,并借助宿主细胞本身的代谢环境、原料、能量和复制场所进行繁殖子代病毒)。然后侵入猪头部与颈部的淋巴结如咽后淋巴结、下颌淋巴结、腮腺淋巴结、气管支气管淋巴结等,并在此继续产生抗体。由于抗体的调理作用导致了ASFV 感染肺部大量的巨噬细胞,经过右淋巴导管或左气管干进入颈静脉、前腔静脉,并随心脏运送到全身毛细血管,建立血管内皮细胞的持续感染和顽固性的病毒血症。ASFV 随血液循环进入肺脏、心脏、肝脏和脾脏后,会引发心肌炎、肝脏脂肪变性与硬化、大叶性肺炎等,导致胸腔、心包与腹腔积液、红染。大量病毒随血液侵入脾脏并刺激B 细胞产生大量抗体,在血管内形成大量可溶性Ag-Ab 复合物,堆积在血管内皮表面,引发内皮细胞损伤,使得炎症趋化因子IL-1、IL-6 和TNF-α 大 量 表 达, 引发毛细血管末梢微血栓形成、多种器官组织的微血管损伤与破裂和Ⅲ型超敏反应,病猪迅速开始表现发病与死亡。
ASFV 的终末宿主为猪和疣猪,唯一的中间宿主为钝缘软蜱。终末宿主和中间宿主相对来说比较单一。其他各种媒介如苍蝇、蚊子、老鼠、飞鸟、人体、土壤、水源及各种用具等只能携带病毒,并不能复制和增殖病毒。
ASFV 只能在宿主细胞内存活与增殖,在非宿主细胞内、其他物体的表面及内部或已经死亡的宿主细胞内都不能增殖,并且其感染性也会逐渐消失,因此,ASFV 在死猪、猪肉制品如腊肉、熟肉、香肠、血肠和肉丸等、粪便、泔水等处只能停留、不能增殖。有必要对所有用具、物品、车辆、人员、饲料和水源等进行严格清洗、消毒或驻留足够长的时间来降低病毒携带量,在接触中间宿主和终末宿主之前让其完全丧失致病力。
2.1.1 消毒是降低环境病毒载量的最有效方式
消毒剂的选择与消毒方式、消毒浓度、消毒温度、作用时间、环境的清洁度、环境中有机物质的含量、水质等因素,对消毒的效果影响非常大。因此,有必要对各种消毒剂、消毒方式等在不同环境中确实的消毒效果进行调查,不可盲目使用。同时,还应避免过度消毒对环境、水源、饲料的污染破坏等,更应避免带猪消毒如湿度增加、温度变化、洁度和刺激度的变化。消毒作用主要体现在两个方面:1)使病毒蛋白质发生变性,利用强酸如甲酸、醋酸、苯甲酸、磷酸、乳酸、丁酸、富马酸及其盐类,强碱如火碱、生石灰及其盐类;2)与病毒蛋白进行不可逆的结合,各种邻苯基苯酚,醛如甲醛、乙醛、戊二醛、苯扎溴铵和十二烷基磺酸钠等,还有各种阳离子表面活性剂如洗涤剂、双链季胺盐、次氯酸盐和碘化合物等,也对ASFV 敏感。在不同环境中,评估消毒药的具体效果。消毒的程序也很重要,各种用具、栏舍最好是先水洗,利用洗涤剂如速清泡洗至物见本色,再用速清1:100 消毒,最后再进行清洗后干燥;对于栏舍周围2 m 范围内先将所有杂物、杂草、粪便、废弃的用具进行严格清理,防止蚊蝇滋生、杂草丛生,然后用3% ~5% 烧碱或20% 的生石灰乳进行严格喷涂;对生产区的道路、栏舍过道和护栏等先进行清扫、水洗和干燥,然后用3% ~5% 的烧碱、20% 的生石灰如喷洒路面或过道、墙壁等。消毒的频率和强度也要把控好,既要达到彻底消毒的目的、又要防止过度消毒,避免对猪场内外环境的生态造成严重破坏,如对水源和土壤的严重污染。对风险区、道路、走道、护栏和耐燃用具等用火焰消毒,是一种非常安全、有效的消毒方式;对饲料库房、药品储存室、实验室和空栏等也可以采用熏蒸消毒。没有感染的猪场严禁带猪消毒和饲料消毒,因为带猪消毒、饲料消毒可能破坏猪的第一道皮肤屏障、消化道和呼吸道黏膜屏障等,加快ASFV 的传播速度。
2.1.2 建立有效的隔离屏障和缓冲带,有利于阻挡ASFV 入侵猪场
有许多安全等级非常高的猪场,也感染了非洲猪瘟,并且逐步提高安全等级也无法幸免,这一点让养猪人感觉到非常恐怖。这是怎么一回事?让人无法理解。但细想一下,再完善的生物安全和消毒措施都有漏洞,所谓 “百密一疏” 嘛!同时单纯的打打杀杀也不是一个事,即使每天都对猪场的每一个角落都进行彻底消毒,其实也做不到100% 杀死细菌和病毒,只要有移动的媒介存在就有可能把新的病毒带入猪场。而移动的媒介如苍蝇与蚊子、老鼠、飞鸟甚至是一阵风也可能把新病毒带入猪场,更不用说飞驰的车辆(五类车:拉猪车、拉料车、拉粪车、私家车、无公害处理车)、移动的人(五类人:杀猪人、拉猪人、养猪人、猪场主、兽医)、移动的扫帚和高压的清洗枪等。在南方来说,即使你做得再好,一场雨就可以使你的所有努力全部都白费。因此,有必要在猪场周围建立起一个有效的隔离屏障和缓冲带,如筑高墙,修建一个至少2 m高围绕整个猪场的隔离围墙,同时在高墙内外各修建一个2 m 宽的隔离带,可以有效阻挡大部分病毒进入猪场,因为ASFV 没长腿走不过2 m,也没有长翅膀飞不过2 m。清除所有杂草、处理所有杂物,防止蚊蝇滋生,并对高墙和内外隔离带严格进行的消毒处理,同时在高墙外围铺上1 m 宽的尖碎石防止老鼠进入猪场,还要防止雨水往猪场内流动,只允许水往外流。
2.2.1 维护猪消化道和呼吸道完整有利于防控非洲猪瘟
黏膜免疫在非洲猪瘟防控上也发挥重要的作用。黏膜系统是机体与外界直接接触、病原体侵入的门户,而非洲猪瘟侵入的门户首选呼吸道和消化道,因此,维护消化道、呼吸道黏膜的完整、维护共同黏膜免疫系统的结构和功能完整非常关键。不同部位黏膜免疫反应相关联形成共同黏膜免疫屏障(CMIS)。SIgA 作用于黏膜局部,是黏膜中关键因子,对维护黏膜上皮细胞之间的紧密连接,对由于食物摄入或由空气吸入的某些抗原物质具有封闭作用;SIgA 与病毒结合,可阻挡病毒粘附于宿主细胞、中和病毒和病毒产生的毒素,增加黏液蛋白酶对抗原降解等免疫清除作用,避免抗原进入机体,从而避免某些超敏反应发生。SIgA 所具有的超高产量、超高免疫清除率,超出了其他所有Ig,能有效防御疾病、维持内环境稳定和防止某些超敏反应与自身免疫病。ASFV 通过鼻、口侵入呼吸道和消化道黏膜后,引发黏膜炎症,SIgA 由SC 介导转运到消化道、呼吸道和泌尿生殖道,应防止转运SIgA 的能力下降,造成CMIS 受损。因此,维护消化道和呼吸道完整有利于防控非洲猪瘟。
饲料熟化对非洲猪瘟防控的效果需要进一步的研究与评估,但饮水的酸化有利于防控非洲猪瘟。有人在大谈特谈颗粒熟化料一定比自配料安全,讨论85 ℃ 3 min、10 min 和20 min 熟化哪个更安全?要说饲料的安全问题,作者的观点是自配料更安全,主要有这几个方面的原因:1)自配料现配现用,营养物质的损耗相对来说比较小,生产过程和原材料质量比较好把控,可以杜绝猪源性动物蛋白如血粉、肠膜蛋白和肉骨粉等使用;2) 自配料的原料粉碎粒径比较大,一般不会引发猪的胃溃疡和呕吐现象,而从实际使用颗粒料饲喂母猪的情况来看,呕吐现象比较多见,这与颗粒料原料粉碎粒径过细容易诱发胃溃疡有一定关系;3)长期饲喂颗粒料的母猪容易发生便秘,而便秘对于防控非洲猪瘟是极为不利的;4)长期饲喂颗粒料更容易引发代谢紊乱,特别在非洲猪瘟防控的关键节点上,饲料要在仓库放置一个月的时间会比较安全,这样自配料就有优势,我们可以考虑将原材料放置一个月时间,而不是把饲料放置一个月时间,而颗粒料的保质期一般为45 d,对于一些氧化活性成分如维生素、抗氧化剂、脂肪等长期保存有巨大的挑战。饲料熟化再加上放置一定时间,饲料中维生素的破坏或损耗可能比较大,因此,长期饲喂这样的饲料有可能引发非常严重的代谢紊乱;5)颗粒料由于熟化的原因,往往在饲喂过程中更容易招蚊子,根据目前的流行病学调查来看,苍蝇、蚊子有传播非洲猪瘟病毒的风险。从以上情况来看,饲料熟化可能加重了猪消化道和呼吸道的破坏,增加了其炎症,对非洲猪瘟防控极为不利,临床观察到一些猪场饲喂猪颗粒料发生非洲猪瘟情况要多一些,也可以为证。凡是造成猪黏膜损伤的因素,必将对非洲猪瘟防控产生不利影响。
2.2.2 提高机体的非特异性免疫功能,有利于提高猪的抗ASFV 感染阈值
ASF 属于免疫亢奋性疾病,机体巨噬细胞的吞噬能力越强、体液免疫产生抗体的能力愈大,病毒的复制、病毒血症和Ⅲ型超敏反应愈强烈,病猪的发病和死亡更快。ASFV 在宿主细胞内建立起各种各样的逃避机制来规避和操纵宿主免疫应答的能力,由于病毒颗粒比较大,吸引巨噬细胞的内吞作用感染猪。在抗体和补体共同作用下促进了其吞噬作用,形成了细胞内病毒颗粒和细胞外病毒颗粒。ASFV 通过干扰Th1 细胞产生干扰素-γ,限制了感染巨噬细胞的活化、抑制其凋亡和自噬作用,不让巨噬细胞产生抗病毒活性并在其周围吸附大量红细胞,确保其存活与加快病毒复制增殖,还阻碍来支援的淋巴细胞。被感染的细胞被血液和淋巴转运至扁桃体、淋巴结、脾脏和骨髓等处产生免疫应答,产生大量非中和抗体,感染后4 ~8 d 往往出现持续性的病毒血症;即使有了中和抗体,其与补体一道也只能识别并中和细胞外游离的病毒颗粒,而对于已经进入细胞内病毒颗粒或已开始复制的病毒则完全无效。持续性的病毒血症与微血管内皮细胞堆积大量可溶性抗原抗体复合物,引发Ⅲ型超敏反应。病毒随着体液、血液排到环境中,病猪成为了活动的风险源,排毒可持续63 ~70 d。
ASFV 的灭活苗对防控非洲猪瘟无效。主要是因为灭活疫苗更多地激活Th2 型体液免疫应答、提高抗体滴度。Th2 细胞分泌IL-4,不分泌IL-2 及IFN-γ,加快病毒的复制、持续性病毒血症和微循环障碍,引发局部组织水肿、坏死、瘀血、大出血和快速死亡。因而组织灭活苗对非洲猪瘟防控不但没有控制作用,反而会加快病毒的传播、加快生猪死亡。其致死的主要机理,是ASFV 感染猪肺血管内巨噬细胞的活化造成肺泡水肿,血液回流受阻,血液中氧气被耗竭而严重缺氧死亡。
在非洲猪瘟防控上,非特异性免疫或细胞免疫应答占主导,如大猪的胸腺萎缩或保育猪蓝耳病不稳定加速了胸腺功能的退化,无法产生足量的T 细胞或有活性的T 细胞,细胞毒性T 细胞(CTL)多为CD8+T 细胞,通过来攻击被ASFV感染的细胞膜,释放穿孔素、颗粒酶攻击靶细胞形成跨膜孔道,引起细胞破裂而死亡;还攻击感染细胞的胞核,通过活化核酸酶,破坏靶细胞和病毒DNA,同归于尽而凋亡(即程序性死亡)。Th1 细胞针对细胞内入侵的宿主细胞诱导干扰素的产生,分泌IL-2、IFN-γ( Ⅱ型,遇酸变性) 及IFN-β(I 型,遇酸稳定),不分泌IL-4,主要参与细胞免疫及炎症反应,抗病毒、抗胞内寄生菌等作用,为易感染动物的早期保护提供帮助。
总之,在非洲猪瘟防控方面,维护胸腺功能防止胸腺过早退化、提高T 细胞和SIgA 的活性、维护呼吸道和消化道黏膜的完整可有效提高猪的感染阈值,同时也需要通过严格的生物安全来降低环境病毒载量,只有双管齐下,才能有效防控非洲猪瘟。