2709碱性蛋白酶水解猪肠黏膜制备肝素工艺条件优化研究

张秋会，徐俊涛，李苗云，赵改名，高晓平

（1.河南农业大学食品科学技术学院，河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室，河南郑州 450002；2.漯河双汇肉业有限公司，河南漯河 462000）

中国是肉制品生产大国，每年猪牛屠宰量达10亿头以上，畜禽副产物资源极为丰富[1-2]，仅猪小肠年产量达50×104t。但是，目前畜禽内脏等副产物的深加工利用率还很低。如何提高畜禽副产物的加工利用率成为了众多企业面临的严峻问题。而副产物的加工利用途径主要是2个方面，一是作为原料加工成为消费者可食用性产品；二是生产具有经济效益的非食用性产品，如药品、塑料、能源物质[3-4]。

肝素是一种抗凝血、抗血栓形成的药物[5-6]。早在1916年，研究凝血机制时在狗的肝脏中被Mclean发现，是一种酸性黏多糖物质[7]，后来被人们证实其抗凝血作用，并广泛应用于临床，得到世界各国的重视[8-10]。在肝素提取制备工艺技术中，酶法[11-12]、超声波提取法[13]、盐析提取法[14]等方法得到了广泛应用，其中酶法具有反应条件吻合、得率高等优点。

因此，试验利用2709碱性蛋白酶，以猪肠黏膜为载体，开展畜产品副产物附加产品的关键技术研究，以黏膜酶解液效价为评价指标，对影响2709碱性蛋白酶水解过程中的各种因素进行优化研究，确定合适的水解工艺条件，为酶法工业化生产肝素提供依据，提高畜产品加工副产物的附加值，促进肉类加工企业发展。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪小肠黏膜，双汇泰威逊食品公司提供；2709碱性蛋白酶（酶活力为20×104U/g），庞博生物工程有限公司提供；肝素钠标准品，USP Rockville，MD.LOT L11033）；绵羊血浆，山东苍山向明生化助剂厂提供；氢氧化钠、乙醇、氯化钠、氯化钙等均为分析纯，市售；UV power紫外可见分光光度计等。

建立信息发布平台，采用大数据、互联网等技术，将近3-5年内可转移转化的科研成果、专利等信息经过整合后汇集至信息平台。将信息平台推广至企业，企业可以查看最新的科研成果，也可发布近期需求。利用大数据等技术将双方信息进行匹配，匹配度高的需要重点关注、重点规划，进行转化。定期开展调研交流、成果展示活动，或聘请一些企业家顾问，打破壁垒，充分了解市场的需求，使高校和企业的信息充分交流互通。

1.2 试验方法

1.2.1 酶活力的测定

叙事语体是以人为本的，以主要人物的活动为线索，展开事件活动，注重时间线性；而描写语体则是以物为本，描述场景中的各种事物状态，注重空间性状的凸显性。在叙事语体当中，动词的功能必须强化，而在描写语体中，动词的功能则表现出弱化的倾向。

1.2.2 小肠黏膜酶解

酶底物质量分数对酶解效价的影响见图3。

1.2.3 肝素效价的测定

料液比对酶解效价的影响见图6。

1.3 单因素试验

我刚投身乡村做了一名小学老师，对教育抱有很大的热情，对学生也关爱有加，没多久，我就和可爱的小天使们打成了一片。那年的栀子花开得格外灿烂，能在乡村看到那洁白醇香的栀子花，我甚是欢喜。走在校园里，孩子们佩戴着栀子花，许多人手中拿着一朵洁白的花，香气充溢着整个校园。其他老师的办公桌上都是大朵大朵的栀子花，它们是那么白，那么香，我满心期待走进自己的办公室，却发现桌上一朵也没有。

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单因素试验因素与水平设计见表1。

在国家和内地的支持下，至2016年，90%以上的学校包括边远贫困地区学校接入宽带，西部、民族及贫困地区教育信息化步伐明显加快，很多西部偏远山村教学点用上了电脑，走进数字化时代，越来越多的乡村学校悄然改变。

1.4 酶解条件优化

依据单因素试验结果，主要考虑水解温度、水解时间、酶底物质量分数等因素，利用Box-Benken设计，进行三因素三水平优化试验。

1.5 数据分析

数据采用SPSS 18.0中的ONE-WAY ANOVA及REGRESSION等程序进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 水解时间对酶解液肝素效价的影响

水解时间对酶解液效价的影响见图1。

图1 水解时间对酶解液效价的影响

由图1可以看出，在1.5～3.0 h时，随着水解时间的延长，酶解液效价逐渐增大；水解3.0 h时达到最大，为6.14，而且显著高于其他各水平，与3.5 h时无显著差异性；在4.0～4.5 h，酶解液效价显著降低。水解时间是影响酶促反应的关键因素，时间短酶促反应未完全进行，时间太长又可能引起肝素的化学结构变化。因此，在规定条件下，3 h是最佳水解时间。

2.2 水解温度对酶解液肝素效价的影响

水解温度对酶解效价的影响见图2。

图2 水解温度对酶解效价的影响

由图2可以看出，随着水解温度的升高，酶解液效价显著增大；54～56℃时酶解液效价达到7.45，显著高于其他各水平；56℃以后，酶解液效价显著下降。酶促反应温度决定酶促化学反应速度，偏离酶最适反应温度的温度均对酶促反应不利。温度过低，酶活力低，反应不完全；温度过高，肝素中N-硫酸基水解失活，降低酶解液效价。因此，2709碱性蛋白酶水解猪肠黏膜最佳水解温度为54～56℃，为便于开展研究，后期选择2709碱性蛋白酶水解猪肠黏膜最佳酶解温度为55℃。

2.3 酶底物质量分数对酶解液肝素效价的影响

首先称取70 g的小肠黏膜样品置于烧杯中，按照试验要求添加2709碱性蛋白酶、水，调整pH值，置于恒温水浴锅中，记录时间，匀速搅拌，进行水解。水解结束后，在85℃，10 min条件下水浴处理，进行灭酶处理。然后收集酶解液，进行酶液肝素效价测定。若不能及时进行测定，密封保存于4℃条件下备用。

图3 酶底物质量分数对酶解效价的影响

由图3可以看出，随着酶底物质量分数的升高，酶解液效价显著增大；0.80%时酶解液效价达到9.28，显著高于其他水平；0.80%以后，酶解液效价显著下降。2709碱性蛋白酶水解小肠黏膜提取肝素，蛋白酶过量可将肝素水解，使其失活，效价降低。因此，2709碱性蛋白酶水解猪肠黏膜最佳酶底物质量分数为0.80%。

2.4 食盐浓度对酶解液肝素效价的影响

食盐浓度对酶解效价的影响见图4。

图4 食盐浓度对酶解效价的影响

由图4可以看出，食盐浓度为0.15～0.30 mol/L时，随着食盐浓度的升高，酶解液效价显著增大；当食盐浓度达0.30 mol/L时，酶解液效价达到10.70，显著高于其他各水平；0.30 mol/L以后，酶解液效价显著下降。食盐浓度的大小与肝素活性及溶解度有关，过高或过低的食盐浓度均不利于肝素钠的提取。因此，2709碱性蛋白酶水解猪肠黏膜最佳食盐浓度为0.30 mol/L。

2.5 pH值对酶解液肝素效价的影响

pH值对酶解效价的影响见图5。

根据响应面统计方法对试验结果进行拟合，得出酶底物质量分数、水解时间，水解温度的拟合方程：

图5 pH值对酶解效价的影响

2.6 料液比对酶解液肝素效价的影响

肝素效价的测定参考文献[15]的方法，用冷冻羊血浆法测定。

由2.1节得到人口数量的非参数贝叶斯估计结果,预测2006—2010年中国人口数量如表3所示.表4为预测均方误差.表4表明在对中国人口数量进行预测时,非参数贝叶斯估计与局部线性回归相比较,均方误差较小,在一定程度上克服了局部线性回归方法在预测外推方面效果较差的问题.

主要考虑影响水解的常规因素，包括水解温度、水解时间、pH值、酶底物质量分数（酶质量与小肠黏膜质量的百分比）等进行单因素试验。考查指标为酶解液肝素效价。

晚期史诗所表现的人物与情节都具有很强的现实性。例如，著名的法兰西史诗《罗兰之歌》，产生于十一世纪初叶，是以现实中的帝王将相武功为内容的叙事体诗歌，在欧洲被称为“纪功歌”，叙述的是九世纪流传的查理大帝和他的勇将罗兰的事迹。众所周知，查理一世(公元742—814年)，或称查理大帝、查理曼，是法兰克国王矮子丕平的儿子，公元769年继承王位，后通过征略成为伦巴德人、托斯卡纳人、萨克森人的国王，公元800年受罗马教皇利奥三世加冕做了皇帝，统治了欧洲大部地区，建立起罗马帝国之后的又一大帝国。史诗中所描写的诸多战役，大都见诸史料记载。例如，诗的开篇写道：

图6 料液比对酶解效价的影响

由图6可以看出，随着料液比的降低，酶解液效价显著增大；料液比1∶7时，酶解液效价达到45.25，显著高于其他水平；料液比1∶7（g∶L） 以后，酶解液效价呈下降趋势。料液比小，搅拌不均匀，酶与底物反应不完全；料液比大，杂蛋白可能溶解，使酶解液效价降低，不利于纯化，生产成本增加。

（1）药品的使用控制。如何规范医生的开单行为，限制药品的滥用是医院永恒的管理问题。医院需要将每个药品的处方权限制到科室和个人，通过药品专家委员会讨论确定诊断和临床科室对应的药品目录，超诊断或科室药品使用目录开单的，信息系统自动提示需要经过相关部门的审批；发现医生存在违规用药行为的，暂停责任医生违规药品的处方权，以此实现对医生开单行为的控制。

2.7 响应面优化及结果

依据2709碱性蛋白酶酶解猪肠黏膜单因素试验结果，利用Box-Benken设计，选择进行三因素（水解温度、水解时间、酶底物质量分数）3个水平响应面优化试验。

试验因素与水平设计见表2，响应面试验结果见表3。

2709碱性蛋白酶活力测定方法参考文献[14]的方法进行，测得碱性蛋白酶活力为9.55 U/mg。

表2 试验因素与水平设计

由图5可以看出，pH值8.2～8.8时，随着pH值的升高，酶解液效价显著增大；酶解溶液pH值8.8时酶解液效价达到7.65，显著高于其他pH值水平；酶解溶液pH值8.8以上，酶解液效价显著下降。因此，选择最佳的料液pH值为8.8。

回归模型方差分析结果见表4。

为更好地保护中国投资者的海外投资利益，且鉴于公司国籍国实施外交保护的权威性，中国宜采取的方案是：将“一国对由于损害的原因按照公司国籍国法律终止存在的公司在合理期限内未能提供外交保护”的情形，纳入股东国籍国实施外交保护的范围。

表3 响应面试验结果

表4 回归模型方差分析结果

由表4可以看出，回归模型具有高度的显著性（p＜0.000 1），失拟项在α=0.05水平上不显著（p=0.072 2＞0.05），说明回归方程与实际情况吻合的较好，误差小，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。

由表4及拟合方程可知，该模型极显著，能很好地解释数据差异性。其中酶底物质量分数、水解时间，对肝素提取的影响表现为极显著。另外，该模型的确定系数为0.995 8，调整确定系数为0.990 3，说明该回归模型对数据的拟合程度较好，适于对肝素提取进行分析及预测。该模型的失拟项为0.004 9，表现为不显著，因此该模型稳定性较好，能很好预测各因素对响应值的影响。

2.8 响应面分析

响应面图形是响应值对应于试验因素所构成的可以反映各因素及因素间的交互作用对响应值的影响。将一个因素固定在零水平，可以作出两因素交互作用的响应曲面图和等高线图。等高线越圆，说明它们之间相互作用对肝素提取的影响越小；而等高线越接近椭圆，表示因素之间的相互影响越大。

酶底物质量分数和水解温度对酶解液效价的影响见图7，酶底物质量分数和水解时间对酶解液效价的影响见图8，水解温度和水解时间对酶解液效价的影响见图9。

图7 酶底物质量分数和水解温度对酶解液效价的影响

图8 酶底物质量分数和水解时间对酶解液效价的影响

图9 水解温度和水解时间对酶解液效价的影响

从图7～图9可以看出，酶底物质量分数和水解时间交互作用对酶解液肝素效价影响最小。

对于保肢失败的患者，不仅身体上痛苦，心理上也有巨大伤害，经济上需承受巨大压力[1]。导致患者截肢的危险因素众多，本研究所指的保肢失败主要有以下2种情况：一种是保肢手术后肢体未能成活，另一种是肢体虽成活但由于引起严重并发症、中途放弃保肢或后期肢体功能差、畸形严重而延期截肢[2]。

2.9 最佳酶解条件确定及验证试验

利用回归方程，在优化条件下，对酶底物质量分数、水解温度、水解时间对应的酶解液效价进行预测和实际测定。

响应优化值与真实值之间的关系见表5。

表5 响应优化值与真实值之间的关系

由表5可以看出，预测值与真实值之间具有98.1%的相关性，可以利用上述回归方程对2709碱性蛋白酶水解肠黏膜过程进行预测和控制。

在应用道路简化模型求解最优路径时，由于初始位置与终止位置并不一定是在某个充电站，而可能在任何地方。因此，在建立道路简化模型时，要将初始位置与终止位置作为虚拟充电站同样纳入模型之中，这样便能实现任意位置的路径规划。

同时，选择编号为“1”的参数进行50 kg猪肠黏膜水解的中试试验，中试结果与预测结果基本一致。因此，根据实际生产条件，2709碱性蛋白酶水解猪肠黏膜最适条件为水解温度55℃，水解时间3 h，pH值8.8，酶底物质量分数0.70%，盐浓度0.30 mol/L，料液比1∶7。

3 结论

通过单因素试验获得了2709碱性蛋白酶（酶活力为9.55 U/mg）水解猪小肠黏膜最佳条件为水解温度55℃，水解时间3 h，pH值8.8，酶底物质量分数0.70%，食盐浓度0.30 mol/L，料液比1∶7。响应曲面优化2709碱性蛋白酶酶解条件为酶底物质量分数0.70%，水解温度55℃，水解时间3 h；验证试验证明该水解条件可行。