禽源布利丹沙门菌的鉴定及耐药性分析

朱天伦，陈 革，缪卫媛，高 尚，杨跃飞，王彦红

(1. 扬州大学兽医学院，江苏扬州225009 ； 2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009)

沙门菌是革兰染色阴性，具有广泛宿主的一种肠道杆菌，可引起多种动物沙门菌病及人类食物中毒和感染性腹泻。其中布利丹沙门菌是一种可引起人类感染的致病菌，在北京、广州等多地引起过多次人类食物中毒，2005年在山东还曾有引起儿童化脓性脑膜炎的报道[1-3]。从禽类病料中分离出布利丹沙门菌的报道较少，为进一步做好疾病防治工作，了解布利丹沙门菌对禽类养殖及人类食品安全的影响，本试验对临床采集到的布利丹沙门菌进行分离鉴定，对其药敏反应及生化特点进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 病料来源 本试验分离得到的3株细菌均来自于2017年7月-10月间扬州大学动物医院收到的送检病死鸡，分别编号J1～J3。J1是江苏扬州宝应的5月龄鸡，饲养100只，死亡率较高，病鸡剖检发现喉部充血，肠道有较多蛔虫和大量的绦虫。J2为江苏扬州1年龄以上的草鸡，饲养10只，死亡2只，送检1只，病程7 d左右。J3为江苏邵伯真武的草鸡，145日龄，饲养400～500只，就诊后用磺胺药，剖检发现肠道有很多大小不一的线虫，肝脏有大小不一的白色坏死灶，胆囊充盈，肠道内容物镜检发现球虫。

1.2 主要试剂 用市售的普通绵羊血和普通营养琼脂粉按常规方法配制成血琼脂平板，按常规方法配制的麦康凯琼脂平板；生化培养管和药敏试纸,购自杭州微生物试剂有限公司；沙门菌属诊断血清,购自宁波天润生物药业有限公司。

1.3 细菌分离培养 挑选病死鸡的肝脏按常规无菌操作接种于血琼脂平板上，放置于37 ℃条件下培养24 h后，挑选疑似单菌落分别在绵羊血培养基与麦康凯培养基上进行纯化培养。观察纯化菌的生长状况和形态特征。

1.4invA鉴定 利用PCR扩增invA基因能特异性检测沙门菌[4]。根据文献方法合成特异性引物[5]，将分离株采用煮沸裂解法制备出细菌基因组DNA模板，并将其进行PCR扩增，PCR体系为25 μL，分别是：2.5 μL 10×Buffer、0.5 μL dNTP、0.2 μL上游和下游引物、0.25 μLTaq聚合酶、19.55 μL 超纯水、2 μL模板DNA。取PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.5 生化试验 用接种针挑取纯化后的细菌单个菌落，分别接种于乳糖、木糖、枸橼酸盐、卫茅醇、蔗糖、尿素、阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、鸟氨酸、麦芽糖、赖氨酸、甘露醇、靛基质、硝酸盐还原、V-P试验、M.R.试验氨基酸对照生化管内反应，置37 ℃条件培养48 h，按生化反应管说明书进行判断。

1.6 药敏试验 采用Kirby-Bauer药敏纸片的方法，采用头孢曲松、氟苯尼考、美洛西林、多粘菌素B、多西环素、新霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、庆大霉素、复方新诺明、链霉素、诺氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、妥布霉素、阿莫西林、头孢噻肟、舒巴坦这18种药敏纸片，在无菌条件下，挑取经过纯化的菌株，涂布均匀于麦康凯培养基上，取药敏纸片贴于平板琼脂面上，于37 ℃条件下培养24 h观察结果，测量出各抗生素纸片的抑菌圈直径。药敏试验抑菌范围标准来自杭州微生物试剂有限公司。

1.7 血清型鉴定 取少量沙门菌A-F多价诊断血清于洁净的玻片上，用接种环挑取绵羊血平板上纯培养的待检菌与之混匀进行玻片凝集试验，同时设生理盐水对照，2 min内观察是否出现凝集现象。在诊断为沙门菌后，再使用O群诊断血清和H诊断血清进行凝集试验。根据诊断结果查阅Kauffman-White沙门菌抗原式确定被检菌的菌型。

2 结果

2.1 细菌分离 病料接种于血琼脂平板培养48 h后出现密布的小菌落,在麦康凯培养基上出现无色、针尖大小菌落。病料J1～J3对应编号为S1～S3。

2.2invA的PCR扩增 经过PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析，3个样品均出现约330 bp目的条带，分离菌株均为沙门菌。

2.3 生化试验鉴定 细菌接种于微量生化反应管内，37 ℃培养48 h，鉴定结果显示善株分离株不能发酵乳糖、蔗糖，能发酵果糖、葡萄糖、阿拉伯糖，不产生硫化氢，不产生吲哚，能还原硝酸盐，V-P试验呈阴性，甲基红试验呈阳性， 均基本符合沙门菌的生化特性。

2.4 药敏试验结果 药敏试验显示，分离株对庆大霉素、头孢噻肟、舒巴坦、妥布霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考有较高的敏感性；对多粘菌素B、链霉素、复方新诺明有较高的耐药性。

2.5 血清型鉴定结果 3株分离菌株与沙门菌A-F多价血清进行玻板凝集试验，结果均出现凝集反应。后用O群诊断血清、H诊断血清分别与分离菌株进行凝集试验，结果显示，分离株与O:9、O:12因子发生凝集，与H：g、H：m、H：q抗原发生凝集，因此，分离株的血清型均为[O9,12:H:g,m,q]，3株分离株皆为布利丹沙门菌。

3 讨论

根据分离株的生长特性、生化特点以及invA鉴定，从送检鸡样品中分离出沙门菌，血清型鉴定结果显示，3株分离菌均为布利丹沙门菌。从药物敏感试验结果来看，3株分离菌对庆大霉素、头孢噻肟、舒巴坦、左氧氟沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考有较高的敏感性，且3株分离菌存在略微的差异，这可能与养殖户使用了不同的药物有关。

虽然并未见布利丹沙门菌对养殖业造成极大危害的报道，但该菌可引起人类感染，一般症状可表现为腹痛，腹泻，呕吐，发热等。查阅相关文献发现[6-13]，布利丹沙门菌引起人类食物中毒多集中于夏季，由天气炎热、卫生条件差、食材不新鲜、冰箱、工具等生熟混放、混用导致交叉污染等原因引起，一般经过3-4 d的治疗便可痊愈。检测出感染布利丹沙门菌的食物多为肉类及蛋类，推测为动物性食品本身携带，而天气炎热，卫生条件差导致了细菌迅速繁殖及传播[6-13]。高温煮沸对细菌有杀灭作用，所以在食物中毒高发季节，应更重视对食品卫生安全的监测，提示人们在食品加工时一定要完全煮熟，并且避免工具的生熟混用。