PD-1/PD-L1信号通路在犬乳腺肿瘤中的研究进展

伍怡佳，姚 华

(北京农学院动物科学技术学院，北京昌平102206)

乳腺肿瘤是犬常见的肿瘤之一，与其遗传、品种、年龄和激素等因素有关[1]。程序性死亡受体-1(Programmed death receptor-1，PD-1)/程序性死亡配体-1(Programmed death ligand-1，PD-L1)信号通路与肿瘤逃逸有关，在乳腺肿瘤的发展过程中有着重要作用。近年来，PD-1/PD-L1信号通路在人类医学上迅速发展，这也为犬乳腺肿瘤的研究提供了参考。

1 犬乳腺肿瘤发病现状

在临床上，犬乳腺肿瘤的发病率与死亡率非常高，占母犬肿瘤发病率的50%，发病率约1.988‰，其中大约50%为恶性肿瘤[2]。乳腺肿瘤是母犬中最为常见的肿瘤，仅次于皮肤肿瘤，公犬较为罕见。乳腺肿瘤在9-11岁老龄母犬中多发，治疗方法较为局限和保守。犬乳腺肿瘤的治疗方法有手术治疗、放射线疗法、激素疗法、化学疗法、光动力疗法(PDT)、中医疗法等。临床上最常用的是外科手术摘除法，但以上治疗方法都具有一定的局限性。

免疫疗法与手术治疗、化疗和放疗并称四大疗法[3]。肿瘤的免疫疗法有细胞免疫疗法、肿瘤疫苗及免疫检查点抑制剂等，其中免疫检查点PD-1/PD-L1是免疫系统中的一种抑制性信号通路。本文整理归纳了PD-1/PD-L1信号通路在犬乳腺肿瘤中的研究情况，以期为宠物临床诊疗提供参考。

2 PD-1/PD-L1信号通路

2.1 PD-1及其配体 1992年，日本学者Ishida等首次发现并从凋亡的T细胞杂交瘤中获得PD-1[4]。PD-1在活化的T细胞，自然杀伤细胞和B细胞上表达[5]。其两种已知配体分别是PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)，PD-L1的表达较

为广泛，在活化的T细胞、B细胞等免疫细胞中表达，在肿瘤细胞中也有表达。除此之外，在人类和小鼠非淋巴器官中也有表达，如心脏，胎盘和肺中；在眼及其上皮、肌肉和血管内皮等组织中也有表达；而PD-L2的表达比较局限，仅在活化的巨噬细胞、树突状细胞和少数肿瘤上表达，因此PD-L1在体内的作用远超过PD-L2[6-7]。

犬PD-1和PD-L1的完整核苷酸序列长度分别为1 781 bp和1 561 bp，并且该序列分别具有编码288个和289个氨基酸。犬的PD-L1序列与牛、人和小鼠的氨基酸相似性分别为87.9%，86.2%和82.4%。与其他物种一样，犬PD-1和PD-L1由假定的信号肽、胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域组成[8]。

2.2 PD-1/PD-L1信号通路的作用

2.2.1 维持免疫耐受 PD-1/PD-L1途径在维持免疫耐受和预防自身免疫性疾病方面具有十分重要的意义。PD-1敲除小鼠在出生后3-4周内，死于自身免疫性淋巴组织增生性疾病；PD-L1缺陷导致小鼠心肌炎和肺炎的发展；阻断PD-1/PD-L1途径加快了小鼠的自发性糖尿病的发展速度[9]。在小鼠器官移植模型中，该途径与免疫排斥反应有关[10]。这些研究表明，PD-1/PD-L1信号通路对维持正常的免疫耐受至关重要。

2.2.2 抑制T细胞功能 PD-1/PD-L1通路通过抑制细胞增殖和相关细胞因子的产生来负向调节T细胞的功能，抑制T细胞的活化和增殖，诱导T细胞的凋亡，躲避机体免疫细胞的清除，形成免疫抑制的微环境。该通路诱导的T细胞衰竭在慢性感染(LCMV，HIV，HBV和HCV)中的研究较为透彻；对于病毒，细菌，寄生虫或蠕虫也有少许研究[11]。

因此，PD-1/PD-L1通路与糖尿病、心肌病、人类免疫缺陷病毒感染、狼疮和其他自身免疫性疾病以及实体肿瘤如肺癌、膀胱癌和乳腺癌等有关。

2.3 PD-1/PD-L1信号通路与其他信号通路 PD-1/PD-L1信号通路与其他信号通路之间存在联系。PD-L1的表达与PTEN、ALK/STAT3信号通路有关[12]。阻断PD-1/PD-L1的机制与PI3K/AKT途径、WNT/β-catenin途径、JAK/STAT/IFN-γ途径、RAS-MAPK等细胞信号传导途径有关[13]。有研究发现，犬肿瘤细胞系中的PD-L1只在细胞表面被检测，而加入IFN-γ后，在绝大多数细胞中检测到PD-L1的表达[3]，证实了JAK/STAT/IFN-γ途径在犬肿瘤细胞系中的存在。

3 PD-1/PD-L1信号通路与肿瘤发生发展的关系

PD-1和PD-L1是一对免疫共刺激分子，当PD-1与位于T细胞上的受体结合时，负向调节T细胞受体的活化信号，抑制细胞毒性T淋巴细胞的功能，造成免疫逃逸[14]。当T细胞被其受体激活时，PD-1同时表达，为被攻击细胞提供逃避免疫反应的途径。一旦免疫反应消除了病理抗原，PD-1就会减少。很多肿瘤或癌症表面大量表达PD-L1，抑制T淋巴细胞的增殖和相关因子的激活，促进肿瘤的生长和发展。

3.1 PD-L1 在犬肿瘤中的表达 Maekawa等通过免疫组织化学的方法检测了犬恶性肿瘤中PD-L1的表达，其中乳腺癌的阳性率为80%，前列腺癌为60%[14]。Shosu等发现犬淋巴瘤标本均为PD-L1染色阳性，而骨肉瘤标本均为PD-L1阴性[3]。Kumar等在犬B淋巴瘤中检测到PD-L1的阳性表达[15]。Coy和Hartley分别通过免疫组织化学、流式细胞术及蛋白质印迹等方法检测到犬T细胞、巨噬细胞和一些肿瘤细胞系中的PD-1或PD-L1表达[16-17]。

上述研究为犬肿瘤的免疫治疗提供基础数据和参考。不同类型肿瘤PD-L1的阳性表达率不同，可能与所研究的样本量大小或犬的品种有关。

3.2 PD-L1在犬乳腺中的差异表达 有研究发现，2只健康比格犬组织标本中PD-L1的表达情况。在垂体、甲状腺、肺、心脏、食道、胰腺、肝脏、肾上腺和肾脏中未见PD-L1的表达；在大脑和小脑、在神经胶质细胞、浦肯野氏细胞轴突和树突中检测到PD-L1表达；在胃和膀胱上皮细胞染色呈阳性；在胸腺、脾和淋巴结中有些淋巴细胞表达PD-L1[3]。PD-L1在犬恶性乳腺肿瘤中表达，但在良性乳腺肿瘤中未见阳性细胞表达[18]。

因此，在犬正常乳腺组织和恶性乳腺肿瘤中均可检测到PD-L1表达。但在犬良性乳腺肿瘤中，PD-L1的表达情况还有待进一步研究。

4 PD-1/PD-L1抑制剂的相关研究

免疫检查点是免疫逃逸的主要机制之一， PD-1/PD-L1抑制剂可以阻断其信号通路，激发机体抗肿瘤反应[19]。其抑制剂可分为抗体药物、肽类及其类似物以及小分子抑制剂[20]。目前，FDA已批准了5种关于人类PD-1/PD-L1抑制剂的药物[21]。

有研究开发了针对犬PD-1和PD-L1的单克隆抗体，这些抗体都会干扰PD-1和PD-L1之间的相互作用[22]。同时，靶向PD-1/PD-L1信号通路的免疫检查点抑制剂与常规的化疗联合使用，可能对肿瘤的治疗有一定疗效[23]。Maekawa等在研究中发现PD-L1单克隆抗体以剂量依赖性方式有效地阻断了重组犬PD-1和PD-L1蛋白的结合，这可能成为犬肿瘤新的治疗策略[8]。有研究体外评估了犬嵌合抗PD-L1单克隆抗体c4G12的免疫调节作用，并对7只患有口腔恶性黑色素瘤(OMM)的犬和2只具有未分化肉瘤的犬进行了试验性临床研究。最后观察到客观的抗肿瘤反应，推断c4G12可能是一种安全有效的治疗犬癌症的方法[24]。

犬乳腺肿瘤是人类乳腺癌免疫学的可靠生物学模型[25]。犬乳腺肿瘤和人乳腺癌之间存在很多相似性，其中包括分子、组织学、形态学、激素、临床和流行病学等方面[26]。因此，犬乳腺肿瘤是研究人乳腺癌的优秀模型，这也为比较肿瘤学提供了很好的机会。

5 展望

随着宠物行业的发展，宠物的寿命得以延长，疾病的发生率和种类也增多。目前，在治疗犬乳腺肿瘤时PD-1/PD-L1途径的联合治疗、不良反应及临床疗效尚不明确，该信号通路与其他通路的相互作用尚不清楚，而犬乳腺肿瘤的精准化、个体化治疗需进一步研究。因此，PD-1/PD-L1抑制剂的应用前景十分广泛。