双波长高效液相色谱法同时检测环孢素A及伏立康唑血药浓度

王林军

（新汶矿业集团有限责任公司中心医院药学部，山东 泰安 271233）

环孢素是目前移植领域最常用的免疫抑制药物，其抗排异作用与用药剂量密切相关，但该药品不良反应多且与用药剂量过大有关，故临床需要对其进行血液浓度监测，以保证用药安全有效[1]。患者在造血干细胞移植后的并发症控制是提高恶性血液病疗效的重要环节，而感染是导致移植失败甚至致死的主要原因，因此，恶性血液病患者行造血干细胞移植后除了服用免疫抑制剂外，往往还需同时服用多种药物[2-3]。当移植患者并发真菌感染时，多需联合使用抗真菌药物，其中伏立康唑属广谱三唑类抗真菌药物，用于治疗非中性粒细胞减少患者的念珠菌血症，可有效治疗原发性或急救性的亚急性侵袭性感染和慢性肺曲霉病等，美国感染病学会（IDSA）制订的曲霉病治疗指南中，伏立康唑是治疗侵袭性曲霉病的首选药物，移植患者出现该真菌感染后往往需合并使用该药物，而该药物在体内的代谢具有多态性，即使使用相同剂量，血药浓度也因人而异，因此，该药临床使用同样需要进行血液浓度监测[4-5]。此外，其与环孢素A联合使用导致的药品不良反应多有报道[6]。本研究中旨在建立一种快速、灵敏、准确且能同时测定两药血药浓度的分析方法，为临床监测其血药浓度提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；208型Milli-Q10纯水器 （美国Millipore公司）；AEG-120型电子分析天平（日本岛津公司）；TGL-20M型台式高速冷冻离心机（湘仪仪器有限公司）。

1．2 试药

环孢素A对照品（百灵威试剂公司，纯度为99．7%）；伏立康唑对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100862-201701）；内标为醋酸可的松及熊果酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为171217-201702，110709-201704）；乙腈（美国 Fisher公司）、醋酸铵（国药集团化学试剂有限公司，批号为20170208）为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件及专属性试验

色谱柱：Diamonsil RP-C18柱（150 mm× 4．6 mm，5μm）；流动相：乙腈 -0．01mol／L 醋酸铵水溶液（65∶35）；流速：1．0 mL ／min；柱温：35 ℃；检测波长：215 nm（环孢素 A），256 nm（伏立康唑）；进样量：20 μL。在此色谱条件下，分别考察空白血清、环孢素A、伏立康唑标准品及血清样品的色谱图，结果血清中内源性杂质不影响环孢素A与伏立康唑的分离度，内源性物质无干扰，伏立康唑及环孢素A保留时间分别为5．32 min和6．48 min。详见图1。

2．2 溶液制备

标准溶液配制：称取环孢素A 10．00 mg，伏立康唑对照品50 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，分别用甲醇溶解并定容，即得环孢素A质量浓度为1 g／L，伏立康唑质量浓度为5 g／L的对照品贮备液，于4℃下保存。取贮备液适量，用甲醇稀释，配制系列浓度的对照品工作液待用。称取熊果酸10．00 mg、醋酸可的松50 mg为内标，精密称定，置 25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得内标溶液（质量浓度分别为400 μg／mL和2 000 μg／mL ），于 4 ℃下保存。

图1 高效液相色谱图

表1 精密度及准确度试验（n＝5）

血清样品处理：量取血清样品 200 μL，1．5 mL离心管中，随即加入内标溶液10 μL，充分混匀，加入乙腈400 μL，涡旋振荡 2 min，沉淀蛋白，以 12 000 r／min 的速率，离心 15 min，取上清液，氮气吹干，200 μL流动相复溶，待分析。

2．3 方法学考察

标准曲线绘制：分别取不同质量浓度的环孢素A及伏立康唑标准溶液各100 μL，加入1 800 μL血清中，混匀，配置环孢素 A终质量浓度分别为 30，90，150，300，600，1 000，1 200，1 500 ng／mL 的标准曲线样品；伏立康唑终质量浓度分别为 200，1 000，2 000，3 000，4 000，6 000，8 000，10 000 ng／mL 的标准曲线样品。按血清样品处理方法处理，以环孢素A或伏立康唑质量浓度为横坐标、环孢素A或伏立康唑峰面积与内标面积比为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程，环孢素A为Y＝68．7 X＋6．241(r＝0．999 4，n＝8)，伏 立 康 唑 为Y＝264．1 X＋9．547(r＝0．999 2，n＝8)，环孢素 A 与伏立康唑质量浓度线性范围分别为30～1 500 ng／mL和 200～10 000 ng／mL[信噪比（S／N）≥3]。

精密度试验：分别配制环孢素A质量浓度为30，600，1 500 ng／mL，伏立康唑质量浓度为 200，4 000，10 000 ng／mL的血浆样品，每个样品平行配制5份，按血清样品处理方法处理，按随行标准曲线计算样品浓度，考察方法学日内、日间精密度。结果见表1。环孢素A及伏立康唑日内、日间精密度均符合生物样品检测标准，RSD均小于15%(n＝5)。

准确度试验：血浆样品配制与操作方法同“精密度试验”，结果见表1。可见，该方法准确度符合生物样品检测标准。

样品稳定性：血浆样品配制方法同“精密度试验”，于室温下放置 0，6，12 h 及 4 ℃下贮存 6，12，24 h 后，按血清样品处理方法处理。结果见表2，可见，血清样品在室温存放12 h内和4℃存放24 h内稳定性均良好，RSD符合生物样品检测标准。

长期稳定性试验：血浆样品配制方法同“精密度试验”，-20℃冷冻贮存，分别于第0，3，7天取出，样品自然溶解后，按血清样品处理方法处理。结果见表3，血清样品在0～7 d内冷冻存放，稳定性良好，样品的 RSD均小于15%(n＝5)，符合检测标准。

表2 室温及4℃血清样品稳定性试验结果（n＝5）

表3 血清样品长期稳定性试验结果（n＝5）

进样待测样品稳定性：血浆样品配制方法同“精密度试验”，按血清样品处理方法处理，分别于进样前将待测样品于室温下放置0，6，12 h及4℃下贮存6，12，24 h后再进样检测。结果见表4。可见，不同质量浓度进样待测样品在室温条件下存放12 h以内及4℃条件下存放24 h的稳定性良好，样品 RSD均小于15%(n＝5)，符合检测标准。

表4 室温及4℃条件下进样待测样品稳定性试验结果（n＝5）

3 讨论

环孢素A又称环孢菌素A，为临床常用免疫抑制剂，主要给药途径为口服或静脉给药，但口服吸收率低且不规则，且有显著的肝、肾毒性，不同人群及个体口服给药后血药浓度差异大，临床疗效也有显著差异，因此，有效监测血药浓度是该药减毒增效的必要手段。环孢素A主要通过肝药酶CYP3A代谢，而CYP3A家族主要参与环孢素A代谢的CYP3A4和CYP3A5存在基因突变，可导致机体对环孢素的代谢加速，致血药浓度降低，显著降低疗效[6-8]。此外，由于其主要有 CYP3A4及CYP3A5代谢，因此环孢素A与影响CYP3A的药物合用时，可引起药物相互作用，影响疗效，甚至发生毒副作用[9-10]。伏立康唑是临床治疗危重真菌感染的一线用药，移植患者易发生感染等并发症，当发生真菌感染后多数患者使用伏立康唑。该药物主要通过肝脏细胞色素P450 同工酶 CYP2C19，CYP2C9 和 CYP3A4 代谢[11]。其中CYP2C19是主要代谢酶，由于其基因多态性导致不同人群服用伏立康唑后体内血液浓度差异较大[12]。同时，该药经CYP3A4代谢，当其与环孢素A联用时，可导致环孢素A血药浓度升高，引起毒性反应。有研究表明，两药合用可导致高血钾反应[13]或癫痫样反应[14-15]。因此，针对两药联用的患者应进行有效的血药浓度监测，但现有监测方法均为独立监测2种药物[16-18]，同一个血样需采用不同的监测方法，效率低。此外，部分医院不同的药物样品往往采取集中监测，导致2种药物的监测结果存在时间差异，不能有效、及时地指导临床治疗。

本研究中建立的双波长高效液相色谱法，其精密度、准确度、稳定性等符合标准，表明该方法可同时检测血清样品中环孢素A及伏立康唑的血药浓度，节省检测时间，为临床同时监测两药提供了有效手段。