金黄色葡萄球菌快速检测测试片培养基的优化

李春梅，王丹，侯典朋，魏丽娜

（1.黑龙江省绿色食品科学研究院哈尔滨150028；2.黑龙江东方学院食品工程，哈尔滨150066）

0 引言

随着人们生活水平的提高，食品安全事件越来越受到人们的重视。金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界中，并且是人类身体上存在的微生物种类之一，大约25%～50%的金黄色葡萄球菌存在与人类的鼻腔当中[1-2]，是世界公认的食源性致病菌之一[3-4]。其产生的肠毒素会导致急性胃肠炎，严重的会引起重大的系统性疾病导致死亡[5-6]。在我国的细菌性食物中毒事件中，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性中毒事件的四分之一。建立快速而准确的检测手段是控制食源性病原菌污染的关键。目前，金葡菌的检测方法主要有BP平板法、免疫学[7-9]、分子生物学快速检测方法[10-12]等。BP平板法虽成本较低，敏感性好，但检测时间较长，操作较繁琐。免疫学、分子生物学检测方法随检测时间短，灵敏度高，但是对于技术人员操作要求较高，不能完全普及。本试验利用金黄色葡萄球菌自身生化特性优化培养基，通过代谢而产生特异性酶或其他特异性物质，在培养基中添加相应的显色底物，使菌落呈现特定的颜色实现分离和鉴别。通过无纺布、冷凝胶、塑料薄膜等作为培养基的载体，将以上材料组装成金黄色葡萄球菌的测试片，缩短了检测时间、降低了劳动强度、节约成本。

1 试验

1.1 材料与试剂

金黄色葡萄球菌标株，大肠杆菌标株、阴沟肠杆菌标株、鼠伤寒沙门菌标株：北京良润实验室提供；蛋白胨、酵母粉，丙酮酸钠，甘氨酸，氯化钠，氯化锂，亚碲酸钾，苯乙醇，聚丙烯酰胺，瓜尔胶。

1.2 仪器与设备

DHP-9272B恒温培养箱，PHSJ-3F精密pH计，BHC-1300IIA 2无菌操作台，KLC-08拍击式均质器，TDL-80-2B离心机。

1.3 方法

1.3.1 测试片的制备

选定三种膜和无纺布组合在一起。上膜材料PP，氧气可以自由通过，无色透明，不抑制生物生长；无纺布吸水性较强，棉质较高，不影响生物生长。中膜材料PEP，对生物没有抑制作用；下膜是合成的硬纸，主要作用是保持平整，起支撑作用；将聚丙烯酰胺与瓜尔胶按1:4混合与培养基混匀放在无纺布上进行烘干，再将上模、无纺布、中膜、下膜安装在一起。

1.3.2 培养基单因素试验

基础培养基，蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂15.0 g，定容1 L，调整最适p H 7.4，添加促进金黄色葡萄球菌生长的物质蛋白胨、酵母粉、丙酮酸钠、甘氨酸，测定金黄色葡萄球菌的总数，将菌落总数转化成对数值(LogCFU)进行统计分析。抑制其他菌生长的物质氯化钠、氯化锂、亚碲酸钾、苯乙醇，测定金黄色葡萄球菌，沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌菌落数。

1.3.3 培养基正交设计试验

根据单因素试验结果，采用L27(38)正交表，设计8因素3水平的正交试验，各因素试验水平见表1。将金黄色葡萄球菌标准菌株接种培养18-24 h，以国标方法作为对照。

表1 正交试验设计表

1.3.4 测试片和BP平板检测结果相关性分析

测试片与BP平板上金黄色葡萄菌菌落数做对比，进行方差分析，为便于统计分析，采用直观菌落数作为统计量。

1.3.5 数据处理

本试验用SPSS、statistix 8.1软件对试验进行设计及数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 培养基单因素试验

2.1.1 促进剂对金黄色葡萄球菌的影响

表2中同列不同字母代表差异性显著（P〈0.05），相同字母代表差异性不显著(P〉0.05)，蛋白胨为金黄色葡萄球菌的生长提供氮源，同时起到缓冲作用，随着蛋白胨浓度的升高，金黄色葡萄球菌菌落数先升高，在16 g/L后差异性不显著，因此从节约角度出发，为了节省能源，和考虑到其它杂菌的生长情况，正交试验蛋白胨浓度选定12、16、20 g/L。酵母粉能促进金黄色葡萄球菌生长及修复。酵母粉浓度在3 g/L后差异性不显著，菌落总数基本保持不变，因此选定2、3、4 g/L。丙酮酸钠能促进金黄色葡萄球菌生长,并能增进选择性,同时可补偿由抑制剂引起的细胞损伤[13]。丙酮酸钠浓度在6 g/L时，金黄色葡萄球菌的菌落总数达到最高，浓度的增加差异性影响不显著，因此正交试验浓度选定4、6、8 g/L。甘氨酸能够促进金黄色葡萄球菌生长，并对其它杂菌没有促进作用。当甘氨酸浓度达到10 g/L，甘氨酸浓度的增加对菌落总数差异性影响不显著，因此选定正交试验浓度为7.5、10、12.5 g/L。

2.1.2 抑制剂对金黄色葡萄球菌及其它细菌的影响

金葡菌具有高度的耐盐性，随着氯化钠浓度增加，对金葡菌之外的其他细菌都具有抑制作用。氯化锂浓度的变化，对金黄色葡萄球菌和沙门菌影响较小，但对大肠杆菌和志贺氏菌的有较强的抑制作用。亚碲酸钾对金黄色葡萄球菌生长影响不大，但对其他菌都具有一定的抑制作用。由于苯乙醇能够阻碍革兰氏阴性菌的DNA合成，从而对革兰氏阴性菌有抑制作用，对革兰氏阳性菌生长无影响。通过单因素试验结果同时考虑培养基的培养性能，确定正交试验氯化钠选定浓度为10、15、20 g/L，亚碲酸钾20、30、40 g/L，氯化锂3、5、7 g/L，苯乙醇3、5、7 g/L。

图1 氯化钠的影响

图2 氯化锂的影响

图3 亚碲酸钾的影响

表2 增菌剂对金黄色葡萄球菌的影响

图4 苯乙醇的影响

2.2 正交设计试验

在培养基中加入抑制剂的作用是抑制非目标菌的生长，但不可避免的会对目标菌产生一定的影响，因此需要加入一些促进剂，使目标菌得到一定程度的保护和修复。为了进一步优化培养基的配方，确定促进剂和抑制剂的添加比例，本试验进行了以下8因素3水平的正交试验。根据正交试验结果可以看出亚碲酸钾和苯乙醇对金葡菌的生长影响最大。其次氯化锂〉氯化钠〉酵母粉〉蛋白胨〉丙酮酸钠〉甘氨酸。结合极差分析，选择水平A3B2C3D3E1F1G2H1，基础培养基的配方确定为：蛋白胨20 g/L、酵母粉3 g/L、丙酮酸钠8 g/L、甘氨酸12.5 g/L、氯化钠20 g/L、氯化锂5 g/L、亚碲酸钾40 m g/L、苯乙醇3 m l/L。

表3 正交试验结果

2.3 测试片和BP平板检测结果相关性

由图5所知，测试片法和国标方法检测结果相关性较好，R2=0.994。说明金黄色葡萄球菌完全可以用测试片法进行检测。

图5 测试片和BP金黄色葡萄球菌相关性

3 结论

以无纺布、冷凝胶、塑料薄膜等作为培养基的载体，通过促进剂和抑制剂单因素和正交试验确定培养基的最佳配方。测试片与传统的检验方法相比具有试验周期短、仪器简单、特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点。