5-Aza对奶牛乳腺上皮细胞中m TOR蛋白和β-酪蛋白表达的影响

王春梅，夏安婷，郑宜文，李庆章，高学军，张莉

（乳品科学教育部重点实验室东北农业大学，哈尔滨150030）

0 引言

目前我国饲养的大部分奶牛都是中国荷斯坦奶牛及其杂交牛，中国荷斯坦奶牛是我国培育的第一个奶牛品种，经过30多年的改良，在遗传稳定性与适应能力上都有了很大的提高，但是与我国现代奶产业的发展要求相比牛奶品质仍有待提高[1]。过去几十年，在对影响奶牛乳产量及乳品质的研究中，人们主要将视线集中在奶牛多条泌乳信号转导方面，而对表观遗传学的研究极少涉足。随着泌乳机制研究的深入，研究者们渐渐意识到表观遗传学也有参与泌乳调控过程的可能。目前为止，国际上关于表观遗传学中的DNA甲基化的研究多针对于癌症领域[2，3]，而奶牛泌乳相关的研究非常少。DNA甲基化是表观遗传学的典型事件，是指在DNA甲基转移酶(DNM Ts)的作用下引入一个甲基（-CH3）修饰5’-Cp G-3’的胞嘧啶，甲基化修饰后可以直接阻止转录因子进入并识别结合基因启动子，从而抑制基因转录[4]。本实验室在分析不同泌乳品质（高乳品质和低乳品质）奶牛的泌乳相关基因的启动子的甲基化状态时发现泌乳相关基因的启动子的甲基化状态在高乳品质和低乳品质泌乳奶牛中存在明显差异，提示DNA甲基化可能参与了泌乳调控。本实验以健康的泌乳期中国荷斯坦奶牛的乳腺上皮细胞为实验模型，通过研究DNA去甲基化药物5-杂氮脱氧胞苷（5-Aza）对奶牛乳腺上皮细胞中m TOR基因蛋白表达水平的影响，试图从DNA甲基化方面揭示影响奶牛乳品质差异的原因，进一步完善奶牛泌乳的分子机制，为我国目前乳品行业发展中面临的困难的有效解决提供更丰富的理论依据，对生产实际及科学理论都有着极其重要的意义。

1 材料和方法

1.1 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养与鉴定

采取消化法（胶原酶Ⅳ，Sigm a）体外分离得到原代奶牛乳腺上皮细胞（BM ECs），使用含有10%血清（胎牛血清，Canada）和青、链霉素的DF12培养液（DM EM-F12培养液，H yclone）贴壁培养于5%CO2、37℃条件下。分离纯化后，采用免疫荧光染色法对细胞进行角蛋白18染色鉴定，按前人所述[5]。使用FITC标记的荧光二抗标记角蛋白18，DAPI标记细胞核。

1.2 5-Aza作用奶牛乳腺上皮细胞的条件

实验前1d将细胞均匀接种于6孔板中，并保持生长状态和生长密度均为一致。第2 d分别向6孔板中添加药物。对照组：10μg/mL催乳素、5μg/mL胰岛素；5-Aza处理组：0.1μmol/mL 5-Aza、10μg/mL催乳素、5μg/mL胰岛素。

1.3 5-Aza对奶牛乳腺上皮细胞活性的影响分析

5-Aza处理细胞48 h后，消化收集以上2组实验细胞，在装有10 mL CASY®ton的CASY®杯加入100μL细胞悬液（对细胞悬液进行1000倍稀释），颠倒混匀，进行3次测量，每次的测量体积为200μL，检测细胞活性。

1.4 mTOR与β-酪蛋白的蛋白表达量检测

0.1μmol/m L 5-Aza处理细胞48h后收取细胞蛋白样品，采用western blotting技术检测m TOR蛋白与β-酪蛋白的表达差异。药物作用48 h后收取细胞蛋白样品，使用SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒配制凝胶，按说明书操作。湿转，转膜时间90 min。一抗mTOR单克隆抗体（Santa Cruz）、β-酪蛋白（Santa Cruz）、二抗HRP-山羊抗兔IgG（北京 中杉金桥）。使用Sag Capture对蛋白条带进行扫描，使用imagine Pro-plus6.0读取蛋白灰度值。

1.5 数据处理与统计分析

所有数据采用SPSS 18.0统计软件进行分析，本实验所有试验重复3次，定量数据结果采用平均数±标准差来表示，组间比较用单因素方差分析，组内比较用t检验并对多组进行了单因素方差分析。P〈0.05有统计学意义，P〈0.01具有统计学极显著性差异。

2 结果

2.1 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养与鉴定

采用细胞免疫荧光染色法检测分离纯化的奶牛乳腺上皮细胞的角蛋白18的表达，结果显示（图1）细胞的细胞核被DAPI染为蓝色，角蛋白18为荧光绿色，说明分离纯化培养的细胞为奶牛乳腺上皮细胞。

2.2 5-Aza对奶牛乳腺上皮细胞活性的影响

图1 奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18的鉴定（100×）

本实验采用所在实验室前期已经确定的5-Aza作用于奶牛乳腺细胞的最优浓度的0.1μmol/mL进行试验[6]。为了进一步验证0.1μmol/mL 5-Aza是否会对奶牛乳腺上皮细胞的正常活性产生影响，5-Aza处理细胞48 h后，本实验进一步使用CASY细胞活力仪测定了5-Aza对奶牛乳腺上皮细胞活性的影响，结果如图2所示与对照组相比，0.1μmol/mL 5-Aza对奶牛乳腺上皮细胞的细胞活力影响不大（P〉0.05），进一步确认可以以此浓度作为实验浓度。

图2 5-Aza对奶牛乳腺上皮细胞的细胞活力的影响

2.3 mTOR蛋白的Western blotting检测结果

5-Aza处理细胞48 h后，分别收取细胞蛋白样品，使用Western blotting技术分别检测对照组和加药处理组的奶牛乳腺上皮细胞中m TOR蛋白的表达变化情况（图3）。结果可见在0.1μmol/L 5-Aza作用下奶牛乳腺上皮细胞m TOR蛋白表达明显高于空白对照组，差异性极显著（P〈0.01）。

图3 5-Aza处理后m TOR蛋白的表达量显著高于对照组

2.4 β-酪蛋白的Western blotting检测结果

5-Aza处理细胞48 h后，分别收取细胞蛋白样品，使用Western blotting技术分别检测对照组和加药处理组的奶牛乳腺上皮细胞中β-酪蛋白的表达变化情况（见图4）。结果可见在0.1μmol/L 5-Aza作用下，奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达明显高于空白对照组，差异性极显著（P〈0.01）。

图4 5-Aza处理后β-酪蛋白的蛋白表达检测

3 讨论

奶牛的表观遗传学的相关研究目前刚刚起步，DNA甲基化参与泌乳的生物学调控机制还需进一步深入研究。DNA甲基化是在保持DNA原有序列的基础上调控基因表达的一种可遗传的基因表观修饰方式，常见于哺乳动物基因组的启动子区[7]。本实验室在分析产乳品质不同的奶牛乳腺组织的基因启动子甲基化水平差异时，发现与泌乳相关的六个重要基因的启动子甲基化水平均显示出显著差异，且DNA甲基化水平与乳品质成负相关，表明DNA甲基化可能参与了泌乳调控[8]。Liu等[9]人的实验结果也呈现出了相似的结果，在不同的泌乳时期，EEF1D基因的甲基化水平也表现出了明显差异。DNA甲基化是一个可逆的过程，在环境变化和生物发育过程中，哺乳动物体内甲基化的形成与去除往往处于动态调节的状态。DNA的去甲基化可以由去甲基化酶主动完成，也可以通过DNA甲基化酶的失活或缺失而被动实现[10]。Frank lyn等人证实5-Aza能通过抑制胰岛素、皮质醇和催乳素而影响乳腺分化[11]。Plachot[12]等在人乳腺上皮细胞中，添加甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞嘧啶，结果显示乳腺上皮细胞的分化程度降低。5-Aza的化学结构类似于Cp G二核苷酸，两者会形成竞争关系，结果导致DNA启动子的甲基化水平下降，所以可使细胞的相关基因甲基化水平受到抑制。所以，本实验也采用5-Aza作用于奶牛乳腺细胞，抑制细胞的DNA甲基化水平进行试验，研究DNA甲基化水平对泌乳关键通路关键蛋白m TOR的表达的影响以及对奶牛泌乳功能的影响。

近年来的研究还表明，营养物质、能量和激素通过PI3K/AKT/m TOR通路对蛋白质翻译的调控可能是决定奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白生成的重要因素[13-14]。mTOR信号通过级联整合营养和内分泌信号，改变翻译起始因子4E（eIF4E）结合蛋白1（4E-BP1）、转录因子和核糖体蛋白S6激酶（S6K1）的表达水平和磷酸化状态从而对乳蛋白的合成起作用[15-16]。本实验从全基因组甲基化水平研究了5-Aza对泌乳关键通路关键蛋白m TOR的表达的影响，发现m TOR的表达与DNA甲基化水平成极显著的负相关，类似的实验结果在神经干细胞[17]与肝癌细胞[18]中也有发现。本实验结果还证明体外条件下5-Aza能显著提高奶牛乳腺上皮细胞中β酪蛋白的表达水平。β-酪蛋白是乳蛋白的主要成分，也是体外泌乳功能研究的标志之一[19]，其表达与m TOR呈正相关关系[20]。不同的激素与氨基酸比例对m TOR的表达及乳蛋白的合成都有着影响，已有的研究表明m TOR能够促进乳蛋白的合成[21]。本实验结果提示5-Aza可能可以通过影响m TOR或其上游蛋白基因的启动子的甲基化状态影响m TOR蛋白的表达水平，最终影响β-酪蛋白的表达水平，影响奶牛乳腺细胞的泌乳功能，进一步表明DNA甲基化也参与了奶牛泌乳调控。本研究从表观遗传学角度探讨了奶牛泌乳调节机制，为改善奶牛牛奶质量、提高牛奶产量研究，促进我国乳制品行业的发展提供了一个新的研究思路。