响应面法优化酪蛋白源多肽制备工艺

汪超，李阜烁，林文珍，陆文昊，范梦珠，陈平，洪志骏，张少辉，

（1.上海交通大学农业与生物学院，上海200240；2.浙江熊猫乳业集团股份有限公司，浙江温州325800；3.浙江辉肽生命健康科技有限公司,浙江温州325800）

0 引言

牛乳中含有丰富的蛋白质，这些蛋白被分解后产生的多肽具有多种生物活性，包括抗菌性、抗氧化性、免疫调节活性、抗高血压、抗炎症、抗衰老等[1-4]。牛乳蛋白中酪蛋白的占比达到80%，是乳源性多肽的重要来源，以其作为底物能够得到很多具有不同生物活性的多肽[5-8]。

目前，乳源性多肽的制取方法主要有两种：通过乳酸菌发酵制备，或利用胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等消化酶进行酶解制备[9-10]。瑞士乳杆菌属于水解性能较强的乳酸菌，在其发酵过程中能够产生丰富的多肽[8,11,12]。

本文结合乳酸菌发酵和蛋白酶水解两种方法，通过菌酶协同的发酵方式，以多肽产量为考察指标，选择胃蛋白酶、复合胰蛋白酶、酸性蛋白酶3种不同的酶作为辅助酶制剂，用瑞士乳杆菌CICC6024作为发酵菌种，研究了发酵时间、酶用量、发酵温度三个因素对酪蛋白源多肽制备的影响，并通过Box-Behnken响应面法对工艺参数进行了优化，为酪蛋白源多肽的生产奠定基础。

1 实验

1.1 材料与试剂

MRS培养基，酪蛋白，乳糖、胃蛋白胨Peptone（来源于酪蛋白），瑞士乳杆菌（CICC 6024），酸性蛋白酶（酶活力1×105U/g），胃蛋白酶（酶活力4×105U/g），复合胰蛋白酶（酶活力2×105U/g），氯化钠（N aC l），等。

1.2 仪器与设备

3 ku超滤管，JB-VS-1300U超净工作台，LRH-250F生化培养箱，GI36T高压灭菌锅，From a 700低温冰箱，RO 15纯水系统，GL-22M高速冷冻离心机，Tecan Infinite M200 PRO酶标仪。

1.3 方法

1.3.1 瑞士乳杆菌的纯化

取少量瑞士乳杆菌C ICC 6024菌粉，接种到M RS液体培养基中，于37℃下培养24 h。用M RS培养基，将菌液进行梯度稀释后，取合适浓度菌液于MRS琼脂培养基上（琼脂质量分数为1.4%）涂布培养，继续培养48 h至长出明显的菌落。挑取单菌落至M RS液体培养基中进行富集培养，继续活化3次后使用和保存。

1.3.2 酶溶液的制备

根据酸性蛋白酶、胃蛋白酶、复合胰蛋白酶不同酶活性，分别称取0.5，0.125，0.25 g酶制剂；溶于10 mL灭菌RO水，配制得到酶活力为5 000 U/mL的酶溶液，依次通过0.45μm滤膜、0.22μm滤膜进行过滤除菌，得到酶溶液待用，每次现制现用。

1.3.3 发酵液的制备

按实验室之前的研究成果[13]，最适的酪蛋白培养液成分为8%酪蛋白、6%乳糖、0.5%N aCl（均为质量分数），最适pH值为6.5，按此条件配置酪蛋白培养液，(95±1)℃杀菌5 min，冰水浴冷却至(37±1)℃。其后接种活化菌液，接种量为6%（体积分数），并按比例加入酶溶液，37℃静置发酵得发酵液，（95±1）℃水浴加热5 min灭酶，冰水浴快速冷却，4℃冷藏待用。

1.3.4 标准曲线的绘制

参考文献[14]中的方法，采用Folin-酚法测定多肽浓度，绘制标准曲线。

称取N a2CO3为1 g，N aOH为0.2 g，酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4 H2O）为0.025 g，充分溶解于RO水中，定容至50 mL，即为A液；称取0.05 g硫酸铜（Cu-SO4·5H2O）溶解于RO水中，定容至10 m L，即为B液，A液和B液于4℃冰箱中保存。A液和B液以体积比50∶1混合，即得到试剂甲，每次现配现用。

称取Peptone 150 m g，充分溶解于RO水中，定容至50 m L，配制成浓度为3 mg/m L的标准肽溶液。用RO水及标准溶液配制成质量浓度分别为0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 g/L的肽溶液。分别吸取以上各质量浓度的肽溶液30 uL于96孔板中，设置5个平行。每孔加入150 uL试剂甲，迅速振荡，于室温下（20～25℃）静置10 min，再逐孔加入15 uL试剂乙（Fo lin-酚试剂），立即混匀，室温下避光静置30 min。用酶标仪测定各孔中溶液500 nm处的吸光值（OD500），以肽浓度为横坐标，OD500值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.5 多肽的提取

取10 m L发酵液，在8 800 g（4℃低温条件下）离心30 min，弃沉淀取上清。得到的上清液用3 ku超滤膜超滤，超滤离心条件为2 500 g，4℃，30 min；收集底部超滤液即得到混合多肽溶液，保存于4℃冰箱中待用。

1.3.6 多肽质量浓度的测定

参考文献[14]中的方法，并做了适当修改，具体步骤如下。对混合肽溶液进行5倍、10倍稀释，取各稀释液用1.3.4中所述方法测定吸光值，根据标准曲线计算肽质量浓度，其计算为

式中：C为实际多肽液质量浓度；C0为多肽稀释液测定所得质量浓度；N为稀释因子。

1.3.7 蛋白酶的筛选

选择酸性蛋白酶、复合胰蛋白酶、胃蛋白酶3种蛋白酶进行实验。在接种瑞士乳杆菌的同时加入蛋白酶溶液，接种量6%(体积分数)，蛋白酶用量20 U/m L，37℃发酵24 h，期间每隔2 h取1次样品，进行多肽质量浓度的检测。

1.3.8 单因素实验

根据试验结果筛选确定最佳蛋白酶后，在蛋白酶用量20 U/m L，发酵温度37℃的条件下，研究发酵时间（0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h）对多肽产量的影响；在发酵时间8 h，发酵温度37℃的条件下，研究蛋白酶用量（0，20，40，60，80，100，120，140，160 U/m L）对多肽产量的影响；在发酵时间8 h，蛋白酶用量60 U/m L的条件下，研究发酵温度（31，34，37，40，43℃）对多肽产量的影响。确定最佳单因素。

1.3.9 响应面优化实验

根据Box-Behnken实验设计原理，在单因素试验的基础上进行响应面法优化试验，以多肽产量为指标，确定最佳工艺参数。

2 结果与分析

2.1 多肽质量浓度标准曲线

邢美孜等人对Fo lin-酚法做出了针对性的改良，使其更适用于多肽浓度的测定。研究了多肽浓度测定用标准曲线的最适标准物质，对BSA、胰蛋白酶降解产物Tryptone和胃蛋白酶降解产物Peptone三种物质进行比较分析后，确定了Peptone为最佳标准物[14]。参考其方法绘制的标准曲线如图1所示。

图1 多肽浓度标准曲线

回归方程为y=0.0604x+0.0073，R2=0.9916。由此可知，Peptone质量浓度在0～3.0 g/L之间时，其质量浓度与吸光度之间具有较好的线性关系。因此，将该曲线作为后续实验的多肽浓度测定用标准曲线。

2.2 蛋白酶的筛选

胃蛋白酶、复合胰蛋白酶是酶解法制备乳源生物活性肽的常用蛋白酶[9,15]，故选择该两种酶进行菌酶协同发酵试验。另外，考虑到菌酶协同发酵时的特殊环境，培养液的pH值会随着时间的延长而不断降低，故又选择添加了酸性蛋白酶进行对比实验。

菌酶协同发酵过程中，发酵时间和不同的蛋白酶对多肽产量的影响如图2所示。从结果可以看出，发酵时间在6 h以内时，胃蛋白酶组、酸性蛋白酶组和不加酶组的多肽产量差异不大，胰蛋白酶组多肽产量较高，但和8 h处的多肽产量相比，仍有较大差距。说明在发酵初期，不同蛋白酶的加入对多肽产量的影响均不大。这个结果可能与蛋白酶的适宜pH值有关，培养液的初始pH值为6.5，该条件下胰蛋白酶活性较强，酸性蛋白酶活性不强，而胃蛋白酶基本无活性。当发酵时间超过6 h之后，各实验组的多肽产量均快速提高，8 h之后，酸性蛋白酶组多肽产量明显优于其他三组，故选择酸性蛋白酶用于后续实验。

2.3 单因素试验

2.3.1 发酵时间对多肽质量浓度的影响

由图2可知，发酵初期多肽产量变化不大，发酵时间超过6 h后，多肽产量出现明显增加，8～24 h之间，多肽产量呈现出上下波动的趋势。在16 h处多肽产量达最高值，质量浓度为（6.10±0.20）g/L，但统计分析结果表明，其与8，14，18 h三个时间的多肽产量均无显著性差别（P＞0.05）。

这可能是由于在瑞士乳杆菌与蛋白酶的协同发酵过程中，瑞士乳杆菌的发酵作用是主要因素，外源蛋白酶只起到辅助作用。前期瑞士乳杆菌的增殖处于迟缓期，培养液酸度不够，故而多肽产量变化不大，6 h后进入瑞士乳杆菌的对数期，多肽产量出现快速提高。这与Ahtesh[16]等人在研究Flavourzym e与几种益生菌的协同发酵时得到的结果类似。后期多肽浓度出现波动可能是由于多肽被瑞士乳杆菌吸收利用所导致的。根据试验结果，结合生产效率的考量，确定发酵8 h为最佳发酵时间，此时多肽产量为（5.77±0.14）g/L。

图2 不同蛋白酶及发酵时间对多肽产量的影响

2.3.2 酶用量对多肽质量浓度的影响

实验结果见图3。根据实验结果，不同剂量的酸性蛋白酶都有助于提高多肽产量，最佳蛋白酶用量为60 U/m L，此条件下，多肽产量为（6.19±0.19）g/L。当酸性蛋白酶用量较少，在20～60 U/m L之间时，多肽产量随着酶用量的提高而增加；当用量高于60 U/m L后，多肽产量呈现出波动下降的趋势。这可能是因为少量的外源性酸性蛋白酶能够提高瑞士乳杆菌菌群的生理活性，促进多肽的产生。而过多的外源性蛋白酶会破坏菌群自身产生的蛋白酶系[17]，影响瑞士乳杆菌的生理活动，使多肽产量下降。

图3 蛋白酶用量对多肽产量的影响

2.3.3 发酵温度对多肽质量浓度的影响

实验结果见图4。根据实验结果，发酵温度对多肽产量影响较大。随着温度的提高，多肽产量呈现出先上升后下降的趋势。当温度达到37℃时，多肽产量达到最高，为（6.18±0.10）g/L。值得注意的是，当发酵温度为40℃时，多肽产量下降并不明显，随着温度的继续升高，多肽产量出现较大幅度的下降。这可能是由于40℃下瑞士乳杆菌的活性比37℃时更强，菌体繁殖更快，但发酵过程中产生的多肽被进一步降解和利用，以满足菌体自身的营养需求[18-19]，所以多肽产量出现小幅下降。而当温度持续上升后，超过菌体的适宜生长温度，多肽产量开始明显下降。

图4 发酵温度对多肽产量的影响

由单因素试验结果可知，酸性蛋白酶与瑞士乳杆菌协同发酵的最佳条件为：发酵时间8 h，酸性蛋白酶用量60 U/m L，发酵温度37℃。以此结果为基础，进行响应面优化实验。

2.4 响应面法优化产肽工艺参数

2.4.1 响应面实验设计与结果

以单因素实验结果为基础，采用Box-Behnken中心组合设计原理，以发酵时间（X1）、酶用量（X2）、发酵温度（X3）为自变量，以多肽产量为响应值进行响应面实验设计，实验设计及结果如表1所示。

采用Design-Expert 8.0.6对试验数据进行多元回归拟合，得到的回归方程为

表1 Box-Behnken实验设计与结果

具体分析结果如表2所示。

表2 响应面实验模型方差分析

由表2可以看出，回归方程模型显著性检测P〈0.0001，极显著，表明该回归方程模型具有统计学意义；失拟项P=0.8202〉0.05，差异不显著，表明拟合情况良好，未知因素对实验结果的影响较小。该模型的确定系数R2=0.9845，调整系数R2Adj=0.9646，说明该模型能解释96.46%响应值的变化，拟合度较好，试验误差较小，可以用此模型对多肽产量进行分析和预测。由显著性检验可知，一次项X1，X2，X3；交互项为X2X3；平方项为X21和X23均为极显著；交互项为X1X2和X1X3；平方项X22为不显著。

2.4.2 响应面分析与条件优化

发酵时间、酶用量、发酵温度三个因素之间交互作用的响应面和等高线如图5-图7所示。

图5 发酵时间和蛋白酶用量的响应面和等高线图（X 3=37℃）

图6 发酵时间和发酵温度的响应面和等高线图（X2=60 U/m L）

图7 发酵温度和蛋白酶用量的响应面和等高线图（X1=8 h）

由图5可以看出，发酵温度固定为37℃时，多肽产量随着酶用量的增加而不断提高，发酵时间小于8 h时，增长较快，而当发酵时间超过8 h后，多肽产量的增长趋势减缓；随着发酵时间的延长，多肽产量先上升后下降，酶用量低于60 U/m L时，下降趋势明显，酶用量高于60 U/m L时，下降幅度很小。根据模型分析的结果，发酵时间和酶用量的交互作用不显著。

由图6可以看出，蛋白酶用量固定为60 U/m L时，随着发酵温度的升高，多肽产量不断提高，随着发酵时间的延长呈现出先上升后下降的趋势，发酵温度低于37℃时，下降趋势明显，发酵温度高于37℃时，下降趋势较小。根据模型分析的结果，发酵时间与发酵温度之间的交互作用也为不显著。

由图7可以看出，发酵时间固定为8 h时，发酵温度低于37℃时，随着酶用量的增加，多肽产量不断提高，而发酵温度高于37℃时，多肽产量基本处于平稳状态，酶用量增加带来的效果并不明显；随着发酵温度的升高，多肽产量先上升后趋于平稳，酶用量低于60 U/m L时平稳阶段到来较晚，酶用量高于60 U/m L时平稳阶段到来较早。根据模型分析的结果，发酵温度与酶用量的交互作用极显著。

根据模型分析的结果，发酵时间、酶用量、发酵温度三个因素的影响作用由大到小排列依次为发酵温度＞发酵时间＞酶用量。通过模型优化，得到的最佳产肽工艺参数为：发酵时间8.78 h，蛋白酶用量59.28 U/m L，发酵温度39.62℃，此条件下理论多肽产量为7.07 g/L。

2.4.3 工艺参数验证试验

为了验证响应面优化法所得结果的准确性，采用上述工艺参数进行多肽的制备。考虑到实验可操作性，将实际的工艺调整为发酵时间8.8 h，酶用量59 U/m L，发酵温度为39.6℃，最终得到的多肽产量为（7.11±0.07）g/L，与模型估计值7.07 g/L相比，相对误差为0.57%，小于5%，响应面法所得的优化条件参数准确可靠，该模型具有实用价值。

3 结论

本实验以酪蛋白为原料，以瑞士乳杆菌为发酵菌种，辅助添加蛋白酶，研究确定菌酶协同发酵对酪蛋白源多肽产量的影响。通过比较不同蛋白酶对提高多肽产量的促进效果，筛选出制备酪蛋白源多肽的最佳蛋白酶为酸性蛋白酶。在单因素试验的基础上，用响应面法进行参数优化，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，得到了多肽产量与发酵时间、酶用量和发酵温度的回归模型。发现发酵时间、酶用量、发酵温度以及酶用量和发酵温度的交互作用对多肽产量的影响均为极显著（P＜0.01）。确定最佳工艺参数为：发酵时间8.8 h，酶用量59 U/m L，发酵温度39.6℃。在此条件下多肽产量为(7.11±0.07)g/L。与原工艺只用瑞士乳杆菌发酵相比，产量提高73.84%。此结果为今后酪蛋白源多肽的生产奠定了基础，有助于酪蛋白源多肽生物活性的研究。