纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)涂覆型手性固定相的制备研究与分离应用

吴海波，薛兴亚，李奎永，周永正*

(1.浙江华谱新创科技有限公司，浙江 温岭 317503；2.中国科学院 大连化学物理研究所 分离分析化学重点实验室，辽宁 大连 116023)

多糖衍生物手性固定相是目前应用最广泛的一类手性固定相。据统计，其应用占据了手性分离案例中的90%。此类固定相最早由日本的Okamoto研究组开发并实现商品化，主要由直链淀粉或纤维素的衍生物通过涂覆或键合到大孔硅胶上制得。其主要分离原理是基于多糖衍生物高度有序的螺旋结构提供了复杂多样的手性环境，从而可与不同构型对映体发生选择性的作用[1-3]。

目前，由直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)和直链淀粉-三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯]分别涂覆制备的AD、OD、OJ和AS柱是选择性最强的4款手性柱[4-6]。由于合成原料简单、易得，纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)(CTMB)涂覆的固定相成为众多研究的对象[7-9]，在手性制备分离上显示了很大的应用潜力。但不同于多糖氨基甲酸酯型衍生物，多糖酯型衍生物由于缺乏分子内氢键作用而导致其晶型结构不稳定，易受涂覆溶剂体系的影响。因此，许多研究发现涂覆溶剂中添加三氟乙酸、苯酚、硝基苯、苯甲酸甲酯等添加剂会对此类固定相的选择性产生较大影响[10-12]。

多糖衍生物涂覆型固定相一般选择氨基化的大孔硅胶作基质。但氨基硅胶自身稳定性较差，另外氨基可能会对化合物产生较强的非对映选择性作用，从而削弱固定相的选择性[13]。本文选择C8硅烷修饰的大孔硅胶作基质，研究了CTMB固定相涂覆时，以氯仿或二氯甲烷作溶剂，分别添加N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、苯酚、硝基苯、苯甲酸甲酯、苯乙酮对选择性的影响，并考察了固定相在手性制备分离上的应用。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

高效液相色谱为Waters 515泵系统，配7725i手动进样器、2489检测器(美国Waters公司)；Elementar Vario EL Ⅲ元素分析仪(德国Elementar Analysensysteme公司)；装柱机、不锈钢空柱管(250 mm×4.6 mm i.d.)由大连思谱精工有限公司提供。

实验所用球形硅胶，平均粒径5 μm，孔径1 000 Å，比表面积25 m2/g(浙江华谱新创科技有限公司)；微晶纤维素(化学纯，国药集团化学试剂有限公司)；4-甲基苯甲酰氯、正辛基二甲基氯硅烷、吡啶、氯仿、DMF、苯酚、硝基苯、苯甲酸甲酯、苯乙酮、无水乙醇(分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1CTMB的合成将10 g微晶纤维素分散于300 mL吡啶中，加入34 g 4-甲基苯甲酰氯，于100 ℃下反应24 h，冷却至室温后，加入1 L甲醇，析出固体，过滤，干燥得28.5 g CTMB；元素分析：C,69.55%；H,5.46%(理论值：C,69.75%；H,5.46%)；凝胶渗透色谱(GPC)测得重均分子量Mw=113 522，聚合度 ～220。

1.2.2C8修饰硅胶将100 g硅胶(5 μm，1 000 Å，25 m2/g)分散于600 mL甲苯中，加入20 mL 正辛基二甲基氯硅烷和60 mL吡啶，110 ℃回流反应6 h。冷却至室温后，加入10 mL三甲基氯硅烷，110 ℃继续回流反应4 h。过滤，甲醇洗涤，50 ℃真空干燥。元素分析：C，1.38%；H，1.11%。

1.2.3涂覆CTMB将2.0 g CTMB溶解于40 mL氯仿中，加入2.0 g苯甲酸甲酯和8.0 g C8修饰硅胶，拌匀，加入15 g直径5 mm的玻璃珠，于旋蒸仪上50 ℃缓慢旋干(约3 h)。旋干后的固定相加入30 mL乙醇，超声分散，过滤(玻璃珠弃除)，加20 mL乙醇洗涤后，将固定相分散于50 mL乙醇中，80 ℃搅拌回流3 h，过滤，50 ℃真空干燥。

1.2.4色谱柱的装填与评价固定相加甲醇匀浆，于50 MPa压力下进行装柱(250 mm×4.6 mm i.d.)，甲醇顶替15 min;系统死时间t0由1,3,5-三叔丁基苯进行测定;分离因子α=(k2-t0)/(k1-t0)。

手性分离条件：流速：1.0 mL/min；温度：25 ℃；检测波长：220 nm或254 nm。流动相：化合物1～4，正己烷-异丙醇(90∶10)；化合物5～7，正己烷-异丙醇-三氟乙酸(80∶20∶0.1)。

2 结果与讨论

2.1 固定相的制备

氨基硅胶的自身稳定性较差，作为涂覆基质可能会因与对映体的非对映选择性作用而影响固定相的手性分离能力。有研究采用C18修饰的大孔硅胶作为基质，制备了选择性与稳定性较好的固定相。但由于C18的位阻作用，多糖衍生物的涂覆受到了一定影响[13]。本实验选择C8修饰的硅胶作基质，并用三甲基氯硅烷进行封尾，减小了基质表面性质对分离的影响。

涂覆多糖氨基甲酸酯多采用四氢呋喃和DMF作为溶剂[1]。多糖酯类衍生物则由于在四氢呋喃中溶解性不高，一般选择氯仿或二氯甲烷作溶剂。由于二氯甲烷沸点较低，蒸发速度不易控制，本实验主要以氯仿作为CTMB的溶剂，考察了不同添加剂的影响。表1列出了12种固定相(CSP 1～12)制备时对应的涂覆条件与元素分析结果。结果显示，固定相CSP 1～12的元素分析结果接近，涂覆量相当。除CSP 1外，其余固定相涂覆后几乎无明显团聚的颗粒。这是因为涂覆时加入的液态添加剂，可以在旋蒸后期减缓溶剂蒸发速度，同时改善CTMB在硅胶表面的传质，保证了涂层的均匀性。另外涂覆时加入一些玻璃珠，加强了固定相涂覆时的流动性，也一定程度改善了涂层的均匀性。

表1 固定相CSP 1～12的涂覆条件及元素分析结果Table 1 Coating conditions of CSP 1-12 and their elemental analysis results

* refers to the weight of additive relative to that of CTMB

2.2 选择性评价

CSP 1～12装柱(250 mm×4.6 mm i.d.)后，正相条件下对其进行评价。图1是手性化合物1～7的结构式。表2列出了手性化合物在CSP1～12上的分离数据，主要包括对映体的保留时间和分离因子(α)，以及化合物1在不同CSP上的分离总塔板数。

图1 手性化合物1～7的结构式Fig.1 Structures of chiral compounds 1～7

CSPPlatenumber*1234567t*1α*t1αt1αt1αt1αt1αt1αCSP 15 3007.831.4617.701.3415.481.217.651.174.582.168.481.217.221.13CSP 28 8007.441.3416.451.2715.201.446.941.364.342.418.301.246.891.14CSP 39 2007.141.5214.241.2913.741.157.131.144.411.908.011.136.891.14CSP 48 0408.151.3719.591.3216.021.357.931.234.712.339.321.287.861.13CSP 57 0007.811.3518.481.2915.531.247.761.234.792.399.441.237.161.11CSP 68 6007.461.3417.051.2815.221.487.161.344.402.568.831.317.011.14CSP 79 1007.951.3619.251.2816.671.467.821.314.762.4810.331.327.941.13CSP 810 0008.461.4121.151.2617.191.328.581.265.122.5010.341.367.501.11CSP 911 5008.921.4523.161.2617.511.179.311.205.622.3111.271.387.871.10CSP107 6008.401.4421.061.2616.421.218.711.215.252.1910.141.357.581.09CSP1110 00010.21.4328.831.2720.861.1610.81.195.972.2611.841.408.621.09CSP127 1007.671.5717.081.2514.731.007.92～14.441.607.641.007.421.08

*plate number:total plate number of the first enantiomer peak of compound 1;t1:retention time of the first eluted enantiomer;α:separation factor of enantiomers

固定相CSP 2、3、4分别涂覆了等量的苯甲酸甲酯、苯酚和硝基苯。与未加任何添加剂的CSP 1相比，前三者均具有较好的装柱柱效，这主要是由于添加剂在一定程度上改善了固定相涂覆的均匀性。选择性上，7个手性化合物均在CSP 1～4上得到分离。相对于CSP 2与CSP 4，CSP 1对手性化合物3、4、5的选择性偏低，CSP 3对于分析物3、4、5、6的选择性则更低，这可能是由于添加剂苯酚含有氢键给体，对CTMB二级结构的影响较苯甲酸甲酯与硝基苯差异较大。

与CSP 2相比，CSP 5将涂覆溶剂由氯仿换成二氯甲烷，其涂覆效果略差，装柱柱效偏低。选择性上，分析物1、2、5、6、7变化不大；但分析物3、4略低。

固定相CSP 2、6、7、8、9、10的涂覆体系相同，其中苯甲酸甲酯的添加量依次增加，分别为30%、50%、80%、100%、150%和200%。分离化合物1的总塔板数依次为8 800、8 600、9 100、10 000、11 500、7 600。柱效先呈增高趋势后又下降，其中以CSP 9的柱效在苯甲酸甲酯添加量为150%时最高。分析物1的保留时间依次为7.44、7.46、7.95、8.46、8.92、8.40 min，分离因子依次为1.34、1.34、1.36、1.41、1.45、1.44，随苯甲酸甲酯添加量的增加亦呈先增加后下降趋势，同样以在CSP 9上最高。推测，随添加量的增加，苯甲酸甲酯与CTMB酯基部分可发生较强的偶极-偶极作用和π-π作用，从而形成更稳定、有益的二级结构，同时涂层涂覆也更均匀。但添加量过高可能会破坏以上结构[7]。另外，实验发现相同条件下CSP 2、6、7、8的柱压比较接近，而CSP 9的柱压相对高出10%，CSP 10的柱压则高出20%。可能是添加剂太多导致一些CTMB未涂覆到硅胶表面，在硅球外部产生了聚合物微粒。对于其它分析物，如分析物3、5，CSP 9与CSP 10的选择性明显较CSP 8低。综合考虑柱效、柱压及选择性，以CSP 8的性能最佳，即涂覆时添加与涂层等质量的苯甲酸甲酯最适宜。

固定相CSP 11涂覆时的添加剂为与苯甲酸甲酯结构相似的苯乙酮。相对于CSP 8，样品保留普遍增强；选择性上，分析物1、2、6、7变化较小，但分析物3、4、5的分离变差。

涂覆添加剂为DMF的CSP 12则表现出柱效偏低，选择性也较差。分析物3、6无分离迹象；分析物4的分离微弱；分析物5的分离也较其它固定相差。推测由于添加剂无苯环，难以与CTMB形成π-π作用，从而使CTMB的二级结构发生了较大改变。

综上所述，CSP 8的性能相对优越。图2为分析物3、4、5在CSP 8上的分离谱图。

图2 手性化合物3、4、5在CSP 8上的分离谱图Fig.2 Chromatograms of chiral compounds 3, 4 and 5 separated by CSP 8

2.3 手性固定相的分离应用

D,L-西孟坦是一种心脏兴奋药，其中L-对映体是主要活性成分。合成L-西孟坦时，往往需要对消旋中间体(8)进行拆分[14-15]。经条件筛选与优化，以纯甲醇作流动相时，西孟坦消旋中间体(8)在CSP 8上得到了较好的分离。分析与模拟制备谱图见图3。分析柱上，该样品每针可上样4 mg。每针周期6 min，1 h可连续进样10针，共上样40 mg，鉴于甲醇消耗量不大，且易回收，该分离具有潜在的工业分离应用价值。

R,S-酮咯酸(9)属于非甾体类镇痛抗炎药物，其S-构型比R-构型的镇痛药效强230倍。关于S-酮咯酸的不对称合成法和消旋体拆分法有较多研究[16-17]。经条件筛选与优化，以甲醇-甲酸(100∶0.1)作流动相时，R,S-酮咯酸(9)在CSP 8上得到了较好的分离。分析谱图与模拟制备谱图见图4。分析柱上，该样品每针可上样10 mg。每针周期10 min，1 h可连续进样6针，共上样60 mg，鉴于甲醇消耗量不大，且易回收，该分离同样具有潜在的工业分离应用价值。

研究结果显示，固定相CSP 8对于西孟坦消旋中间体与酮咯酸消旋体的拆分具有分离效率高、溶剂成本低的特点，具有一定工业分离应用潜力。

3 结 论

为研究涂覆型纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)手性固定相的制备，本文以C8硅烷修饰的大孔硅胶作基质，考察了氯仿或二氯甲烷作溶剂时，分别添加DMF、苯酚、硝基苯、苯甲酸甲酯与苯乙酮对所涂覆固定相的影响。对比发现，添加剂为硝基苯或苯甲酸甲酯时效果较好；DMF作添加剂时选择性最差。同时固定相的柱效、保留及选择性与添加剂量也有一定关系。添加剂可能通过氢键作用，偶极-偶极作用或π-π作用影响纤维素酯的二级结构，从而影响固定相的选择性。而涂覆时添加与纤维素酯等质量的苯甲酸甲酯可制得分离能力相对较好的固定相，其对于西孟坦消旋中间体和酮咯酸消旋体展现了良好的手性拆分能力。