黄麻链霉菌AUH-1抗菌活性物质发酵优化研究

杨 勇，张 勇，李书琴，章帅文，刘 群，李昆太



黄麻链霉菌AUH-1抗菌活性物质发酵优化研究

杨 勇，张 勇＊，李书琴，章帅文，刘 群，李昆太*

（江西农业大学 生物科学与工程学院，江西 南昌 330045）

黄麻链霉菌AUH-1具有广谱拮抗作用，能产生对水稻纹枯病菌、西瓜枯萎病菌等多种植物病原真菌具有强烈抑制作用的活性物质。采用响应面法对黄麻链霉菌AUH-1培养基成分中的碳源、氮源进行优化，以期提高黄麻链霉菌AUH-1对水稻纹枯病菌的抑制效果。利用不同碳氮源进行单因素实验，根据单因素实验结果确定碳氮源水平，应用Design-Expert 8.05b软件中Box-Benhnken设计响应面试验，得到黄麻链霉菌AUH-1发酵培养基的最优配比组合浓度。结果表明，优化后培养基的成分浓度为蔗糖3.1%、玉米淀粉0.25%、玉米浆4.5%、硫酸铵0.375%，在此浓度配比下黄麻链霉菌AUH-1对水稻纹枯病菌的抑制效果最佳，模型预测值为70.504 1%，实际优化值达到69.31%，相比基础培养基提高了5.78%。为进一步研制水稻纹枯病生防制剂和杀菌剂奠定基础。

黄麻链霉菌AUH-1；水稻纹枯病菌；响应面法；培养基；抑制率

由立枯丝核菌（Kühn）引发的水稻纹枯病已经成为全球性的病害[1]，是水稻4大真菌病害（纹枯病、稻瘟病、稻曲病和恶苗病）之一[2]，该病在集约化种植系统中严重地阻碍了水稻的高产和稳产[3]。因此提高病虫害防治的有效性[4]，显示出越来越广阔的应用前景。鉴于此，筛选拮抗菌株，开发新型农用抗生素对于水稻纹枯病的防治具有重要的指导意义。

迄今为止，从自然界中发现的上万种天然抗生素中，约70%是由放线菌产生的。放线菌AUH-1是本课题组从江西农业大学后山土壤中分离得到的一株放线菌。通过多项分类，确定菌株AUH-1隶属于黄麻链霉菌（）[5]，该菌株的次级代谢产物能抑制包括在内的多种植物病原真菌，如西瓜枯萎病菌（f. sp.）、辣椒疫病菌（）和烟草黑胫病菌（）等。因此，黄麻链霉菌AUH-1可以作为有潜在开发价值的抗生素产生菌。本文就其发酵条件进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 黄麻链霉菌（）AUH-1菌株：由本实验室自行分离筛选获得，甘油冻存管-20℃保存。

1.1.2 测试菌株 水稻纹枯病菌（）由本实验室保存。

1.1.3 培养基 指示菌培养基：（1）PDA培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然。（2）高氏一号培养基：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2~7.4。

发酵基础培养基：蔗糖40 g，玉米淀粉20 g，玉米浆20 g，(NH4)2SO42 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，MnSO40.01 g，ZnSO40.01 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2~7.4。

所有培养基均在121 ℃灭菌30 min备用。

1.2 方 法

1.2.1 菌株培养 菌种活化：将保存的AUH-1菌株接种于斜面培养基，28 ℃培养7 d。黄麻链霉菌AUH-1新鲜斜面用1 cm´2 cm规格的接种铲挖菌块，接入发酵培养基中（装液量：100 mL/500 mL三角瓶），在28 ℃、180 r/min摇床培养6 d，收集发酵液，加入2倍体积工业酒精浸提48 h，离心，取上清液经减压浓缩至酒精蒸干，浓缩液用0.22mm无菌微孔滤膜过滤，即为发酵粗提液，存于4 ℃冰箱，备用。

1.2.2 抗真菌活性物质的生物测定 采用抑制菌丝生长速率法，将指示菌水稻纹枯病菌接种至PDA平板上，在28 ℃下培养7 d，用直径为6 mm打孔器打取菌落边缘菌块作为接种物，接种至含有发酵粗提液的PDA平板上，以含等量无菌水的PDA平板为对照，培养48 h后采用十字交叉法测定菌落大小，按公式1算出菌丝生长抑制率。

1.2.3 菌体生长量的测定 以菌丝体干质量来计算菌体的生长量，收集各组培养液50 mL至已称质量(W0)的50 mL离心管中，12 000 r/min离心10 min后弃上清，将离心管连同菌丝一起置于80 ℃鼓风干燥箱中烘至恒质量(W1)，根据公式2计算每升发酵液中的菌丝体干质量(W)。各处理做3次重复。

=(1-0)×20 （2）

1.2.4 发酵培养基优化 首先采用单因子试验，对碳源、氮源成分以及浓度进行优化，然后在单因子试验的基础上利用Box-Benhnken原理设计3个水平、4个因素的响应面分析，并探究各因素及浓度对响应值抑制率影响的显著性以及最好的培养基组合[6]。

1.2.5 试验数据统计与分析 采用Microsoft excel 2016进行数据整理，origin 9.0和DPS 7.05进行作图和差异显著性分析，Box-Benhnken Design试验结果的方差分析采用Design-Expert 8.05b进行因子分析和响应面分析（≤0.05）。

2 结果与分析

2.1 黄麻链霉菌AUH-1培养条件的确定

2.1.1 培养基最适碳、氮源的确定 在该实验供试的5种碳源及5种有机和无机氮源中，黄麻链霉菌AUH-1利用蔗糖为碳源、玉米浆为有机氮源和硫酸铵为无机氮源时，最有利于菌丝体和抗菌活性物质的生成。由图1A可知，不同的碳源处理对于黄麻链霉菌AUH-1抗菌活性物质和菌体量有明显的影响；几种碳源对AUH-1产生的活性物质对纹枯病菌的抑制效果从高到低依次为蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖和乳糖，当蔗糖为碳源时，菌体产抗菌活性物质含量达到最大值，且与葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖和乳糖差异显著。虽然麦芽糖作为发酵碳源较其它的碳源可获得更高的生物量，但该条件下抗菌活性物质明显低于蔗糖作为碳源时所产活性物质，且麦芽糖成本明显高于蔗糖，因此选择蔗糖作为碳源。

对黄麻链霉菌AUH-1生长量及其产活性物质的影响来说，不同有机、无机氮源的培养基产抗菌物质含量由大到小依次为玉米浆、蛋白胨、黄豆饼粉、牛肉膏和酵母膏，硫酸铵、硝酸铵、磷酸氢二铵、氯化铵和硝酸钠。当有机氮源为玉米浆，无机氮源为硫酸铵时，与其他有机氮源差异显著，且该条件下的菌体量也达到最大值。酵母膏、硝酸钠和氯化铵等产生的抗菌活性物质较少。因此，选用蔗糖，玉米浆和硫酸铵作为碳、氮源作进一步试验。

图1 碳、氮源种类对R. solani抑制率及S. corchorusii AUH-1生长量的影响

2.1.2 培养基最适碳、氮源浓度的确定 由图2可以看出，蔗糖、玉米淀粉、玉米浆和硫酸铵等营养成分的添加量对抑制率及AUH-1菌株生长量的影响较为明显。当蔗糖、玉米淀粉、玉米浆和硫酸铵浓度分别为4.0%、0.5%、3.0%和0.25%时，AUH-1菌株所产抗菌活性物质的含量均高于碳、氮源的其他浓度，且该系列浓度下的菌体生长量仍保持着较高水平，既满足了菌体生长，又得到了所需的抗菌活性物质。因此，选用该系列碳、氮源浓度作进一步的实验。

图2 碳、氮源浓度对R. solani抑制率及S. corchorusii AUH-1生长量的影响

2.2 响应面优化培养基的组成

2.2.1 试验设计与结果 根据单因素实验确定的蔗糖、玉米淀粉、玉米浆及(NH4)2SO4等因素的水平范围，用Design-Expert 8.05b软件设计响应面试验，进行了4因素3水平的29组实验。因素水平表见表1，实验结果见表2。

表1 响应面试验因素水平表

表2 响应面优化实验设计与结果

2.2.2 响应面回归模型的建立与方差分析 培养基组分优化的目的不仅是为了提高菌体量，更重要的是为了得到能够高产抑菌活性物质的培养基配方。以为指示菌，以黄麻链霉菌AUH-1发酵液的抑制率（）为响应面，利用Design-Expert 8.05b软件对其进行回归拟合，以A、B、C、D为自变量对抑制率进行数据拟合建立如下多元二次回归数学模型：

=0.42´-0.52´-0.72´+0.62´+0.43´´-0.45´´-0.18´´-0.13´´-0.65´´+0.60´´- 0.76´2-0.70´2+0.81´2+0.20´2，

其中为抑制率，A、B、C、D分别为蔗糖、玉米淀粉、玉米浆、(NH4)2SO4。对回归模型进行可信度分析和方差分析，结果见表3。

由表3可知，模型=3.91，-value=0.007 8<0.01，表明回归方程极显著。失拟项为0.210 8，大于0.05，说明该模型失拟项不显著，表明该模型的模拟性比较良好，建立的回归方程能运用于AUH-1菌株产抗菌活性物质液体发酵培养基优化的理论预测。由表3可以得出，因素A、C对AUH-1菌株产抗菌活性物质的影响效应均不显著；因素B、D对AUH-1菌株产抗菌活性物质的影响效应显著；因素B、C之间对AUH-1菌株产抗菌活性物质的交互影响极显著，其他因素之间的交互影响效应不显著；因素A2、B2、C2对AUH-1菌株产抗菌活性物质的影响效应显著，而D2对其影响效应不显著。

表3 回归方差分析

*表示<0.05，差异显著；**表示<0.01，差异极显著。

利用Design-Expert 8.05b软件根据多元二次回归方程绘制了相应的三维响应曲面图，如图3所示。用图3对黄麻链霉菌AUH-1产抗菌活性物质的影响的任何两种因素之间的交互效应进行分析，进而确定最佳因素水平。从图3可以看出，蔗糖和玉米淀粉间交互作用呈现典型的先升高后降低趋势。

图3 各因素交互作用对S.corchorusii AUH-1产抗菌活性物质的影响

2.2.3 黄麻链霉菌AUH-1产抗菌活性物质的培养基最适组合 回归方程对AUH-1菌株产抗菌物质相应面试验拟合良好，因此，可用回归方程对此试验结果进行优化分析。通过软件进行分析预测，预测的抑制率为70.504 1%，此时蔗糖含量为3.1%、玉米淀粉含量为0.25%、玉米浆含量为4.5%、硫酸铵含量为0.375%。为了进一步检验模型的有效性，按照最佳配方配制发酵培养基，以相同的摇瓶发酵条件进行平行实验，已基础发酵培养基为对照，测得优化培养基抑制率均值为69.31%，与理论预测值相比，其相对误差为1.69%，在可接受范围内，基础发酵培养基的65.52%，抑制率相比提高了5.78%，说明优化结果可靠。

3 结论与讨论

黄麻链霉菌AUH-1对水稻纹枯病菌有较强的抑制作用，但利用发酵液进行生物防治在运输、储存和成本等方面都存在着诸多的不便，因此从发酵液中提取分离和纯化得到抗菌物质显得尤为的重要，而发酵培养基对活性物质的代谢合成具有十分重要的影响[7]。因此本研究通过改良发酵培养基来获得更高的活性物质产量。在工业微生物的药物发酵生产中，葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖等糖类物质都是常用的速效碳源。而葡萄糖在所有碳源中是最易利用的，自然界中几乎所有的微生物都能利用葡萄糖，因此葡萄糖常常用作培养基的一种主要营养成分[8]。从单因素实验优化结果可以看出，黄麻链霉菌AUH-1在以速效碳源蔗糖为唯一碳源时，其菌体浓度及所产抗菌活性物质含量显著高于长效碳源可溶性淀粉时的菌体浓度和活性物质含量。根据文献[9]报道，黄麻链霉菌NF0919在以可溶性淀粉和马铃薯淀粉为发酵碳源时，发酵代谢产生的过量葡萄糖会加速菌体的呼吸，使培养基中的溶解氧（DO）不能满足菌体生长需要，从而使一些酸性中间代谢物，如乙酸、乳酸和丙酮酸等不能被完全氧化而积累在菌体和培养基中，导致发酵液pH降低，进而抑制菌体生长和产物合成。此外，有机氮源和无机氮源也是构成放线菌发酵培养基重要的组成部分，微生物在含有机氮源的培养基中常常会表现出生长旺盛，而且微生物在有机氮源培养基中，会直接利用氨基酸和其他有机氮化合物中的各种不同结构式的碳架，合成生命所需的蛋白质和其他物质，而无需从糖代谢的分解产物合成所需物质[10]。

相比于一般的正交实验和单因子实验，响应面分析法由于周期短、试验次数少，又能够同时研究多个因素之间的交互作用，并且求得的回归方程精确度较高，是优化生产加工条件、降低生产成本、获得更高质量的产品、解决生产过程中实际问题的一种非常有效的统计学办法[11]，目前已被广泛运用于生物领域[12-15]。本试验首先从单因素实验出发，利用Box-Benhnken试验设计和响应面优化分析确定蔗糖、玉米淀粉、玉米浆和硫酸铵的最佳因素水平分别为3.1%、0.25%、4.5%和0.375%。最后按照响应面优化的培养基进行验证试验，得到实际抑制率为69.31%，与模型预测值的相对误差为1.69%，并且，相对于基础发酵培养基的65.52%，抑制率相比提高了5.78%。

笔者通过前期研究发现，黄麻链霉菌AUH-1的发酵产物对多种植物真菌病害的病原菌都具有拮抗作用，因此其具有成为抗生素产生菌的开发潜力。本试验得到该菌株的最佳发酵培养基和发酵条件，为黄麻链霉菌AUH-1进一步的工业开发利用奠定了基础。

[1]吴志明, 李昆太. 水稻纹枯病的危害及其微生物防治概述[J]. 生物灾害科学, 2018, 41(2): 81-88.

[2] 潘以楼. 水稻主要病害的发生及其杀菌剂应用进展[J]. 农药市场信息, 2018, 2(17): 6-10.

[3]曹琦琦, 周登博, 郑丽, 等. 水稻纹枯病菌拮抗菌的筛选、鉴定及培养条件探索[J]. 中国生物防治学报, 2013, 29(2): 270-276.

[4] 黄炽辉. 生物防治在农业病虫害防治中的应用[J]. 种子科技, 2018, 36(7): 95.

[5]章帅文, 杨勇, 刘群, 等. 拮抗植物病原真菌AUH-1的分离与鉴定[J]. 广东农业科学, 2018, 45(2): 103-108.

[6]吴翔, 甘炳成, 谢丽源, 等. 响应面法优化细菌MY07产IAA液体发酵培养基[J]. 生物技术, 2015, 25(2): 201-204.

[7]卢彩鸽, 董红平, 张殿朋, 等. 解淀粉芽胞杆菌MH71摇瓶发酵培养基及发酵条件优化[J]. 中国生物防治学报, 2015, 31(3): 369-377.

[8]王娅婷, 李新兰, 郭志勇. 海洋微生物源生物农药研究进展[J]. 安徽农业科学, 2010, 38(2): 785-787.

[9]杨敬辉, 吉沐祥, 陈宏州, 等. 黄麻链霉菌NF0919菌株发酵培养基的优化[J]. 江西农业学报, 2012, 24(10): 136-139.

[10] 陈坚. 发酵过程优化原理与实践[M]. 北京: 化学工业出版社, 2002.

[11] 韩兴, 刘亚南, 甄丹妹, 等. 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63产抗生素发酵培养基的优化[J]. 江苏农业科学, 2017, 45(10): 100-103.

[12] Jung J P, Moyano J V, Collier J H. Multifactorial optimization of endothelial cell growth using modular synthetic extracellular matrices[J]. Integrative Biology, 2011, 3(3): 185-196.

[13] Li X Y, Liu Z Q, Chi Z M. Production of phytase by a marine yeastBG3 in an oats medium: Optimization by response surface methodology[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(14): 6386-6390.

[14] Zhang C H, Ma Y J, Yang F X, et al. Optimization of medium composition for butyric acid production byusing response surface methodology[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(18): 4284-4288.

[15] Li C, Bai J, Cai Z, et al. Optimization of a cultural medium for bacteriocin production by, using response surface methodology[J]. Journal of Biotechnology, 2002, 93(1): 27-34.

Study on Fermentation Optimization of Antifungal Active Substance ofAUH-1

YANG Yong, ZHANG Yong＊, LI Shu-qin, ZHANG Shuai-wen, LIU Qun, LI Kun-tai*

(School of Bioscience and Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

AUH-1 had broad-spectrum in suppressing the growth of various fungal plant pathogens, such asandf.sp.. In order to improve the inhibitory effect ofAUH-1 on, the response surface methodology was used to optimize the carbon source and nitrogen source in the culture medium in this paper. A single factor experiment was designed and tested with different concentration of carbon source and nitrogen source. According to the test results, the carbon source and nitrogen source were selected as variables. Design-Expert 8.05b Software was used in the design of the test group of Box-Benhnken, the data were analyzed by using Design-Expert 8.05b software, and the optimal combination concentration of carbon source and nitrogen source was obtained. The results showed that the optimal component level of each factor was 3.1% sucrose, 0.25% corn starch, 4.5% corn steep liquor and 0.375% ammonia sulfate, and the inhibitory effect ofAUH-1 onwas the best under this concentration. The model prediction value was 70.5041% and the actual optimized value was 69.31%, which was 5.78% higher than that of the basic medium. This study laid a foundation for the further development of rice sheath blight bio-control agents and fungicides.

AUH-1;; response surface methodology; culture medium; inhibition rate

S467

A

2095-3704（2018）04-0268-07

2018-10-29

国家自然科学基金项目（209005220）、江西省（青年）自然科学基金重大项目（20143ACB2100）和江西省青年科学家培养计划项目（20142BCB23025）

杨勇（1993—），男，硕士生，主要从事微生物资源利用方面的研究，wy931221@sina.com，＊为共同第一作者；

李昆太，教授，博士，atai78@sina.com。

10.3969/j.issn.2095-3704.2018.04.57

杨勇, 张勇, 李书琴, 等. 黄麻链霉菌AUH-1抗菌活性物质发酵优化研究[J]. 生物灾害科学, 2018, 41(4): 268-274.