脑灵汤对阿尔兹海默病模型大鼠NF-κB和IκB表达的影响*

李 玲，呼兴华，吴 永，张选国△

1.陕西省中医医院老年病科 (西安710003)；2. 陕西省中医药研究院文献所 (西安710003)；3.陕西省中医药大学2016级研究生 (咸阳 712046)

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种退行性神经系统疾病。其主要临床表现为认知障碍、行为异常、忽视亲属、无法照顾自己。它给社会和家庭带来沉重的负担。

因此目前对AD发病机制的认识及其治疗显得尤为重要。AD的主要病理特征是Aβ淀粉样蛋白沉积形成的老年斑和过度磷酸化的Tau蛋白形成的神经纤维缠结。随着AD的发展和完善，炎症反应理论越来越受到人们的关注[1]。何明大主任医师的经验用方脑灵汤，其组成为淫羊藿、何首乌、白参、红景天等药,其功能为补肾益气填髓、活血开窍祛痰。通过查阅文献，发现淫羊藿苷、红景天苷均能抑制炎症反应的发生[2-3]。为了观察脑灵汤对AD模型大鼠的保护作用及其初步探讨相关的炎症机制，采用双侧海马CA3区注射Aβ1-42[4]。具体方法及结果如下。

材料与方法

1 实验动物 健康清洁级Sprague-Dawley (SD)大鼠40只(280±30 g，雌雄各半)，由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供。动物条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》，湘雅二医院实验动物室,湿度控制在45%～60%,温度在20℃～30 ℃，明暗比为1∶1，白12 h夜12 h。

2 药物及试剂 脑灵汤组成为淫羊藿、红景天、何首乌、白参等八味药,由中南大学湘雅二医院药剂科提供。脑复康片杭州民生药业集团有限公司生产,批号:080315。Aβ1-42、一抗NF-κB(p65)、一抗IκBа均购于北京博奥森生物公司，余常规试剂均来源中南大学湘雅二医院实验室。

3 方 法

3.1 造模方法：首先使用10%水合氯醛(350 mg/kg)按大鼠体重计算对大鼠进行麻醉，将其固定在脑立体定位仪上，正中竖着划开长约2～3 cm切口，剥离皮下组织及骨膜，暴露前囟，以bregma点为原点(十字中心)，使用此点的三坐标位置(前囟后3.0 mm、左右旁开2.2mm、皮层往下2.8 mm)，用5 μl微量注射器将10 μl(每侧5 μl)Aβ1-42溶液分别缓慢注入左右两侧海马区。假手术组注射等量医用生理盐水。造模后对所有存活大鼠进行行为学实验，有行为记忆能力下降的动物纳入实验研究，否则不纳入。

3.2 动物分组：所有动物在统一条件下,每周记录体重变化,观察一般情况，记录异常等。待所有动物适应环境后进行实验。分为五组：正常组、假手术组、模型组、西药组(脑复康组)、中药组(脑灵汤组)，每组8只，正常组和假手术组给予等体积生理盐水(10 ml/kg)连续30 d，中药组给予脑灵汤10 ml/(kg·d)(脑灵汤连续30 d)；西药组脑复康溶液以10 ml/kg计算(临床等效测量比例分别为成人和动物体表面积的15倍),1次/d，连续30 d。分组时依照随机数字表法。

3.3 行为学检测：采用Y迷宫实验和Morris水迷宫实验进行行为学检测。Y迷宫实验中观察电击刺激后大鼠逃逸至安全区的反应。以连续9次以上达到正确反应所需的电击总数作为学习成绩的标准，以学习后10次电击中的正确反应总数(N/10)作为记忆成绩的标准。Morris水迷宫实验中，大鼠在水池中游泳，直到发现藏在水下的平台。每天早晨和下午训练一次，持续3 d，得到隐藏的平台搜索数据，反映了大鼠的学习能力。第4天，平台被移除，在60 s内测量大鼠穿过目标(原始平台位置)的次数为探索性实验数据，反映了大鼠的记忆能力。为了消除感觉和运动功能障碍对空间学习和记忆的影响，进行可视平台实验。

3.4 刚果红染色：从冰箱中取出冷冻切片，放入多聚赖氨酸玻片上，自然空气在室温下干燥，Harris苏木精5～10 min，自来水冲洗几分钟；1%盐酸乙醇处理几秒钟，自来水冲洗几分钟；0.5%甲醇刚果红染色15 min，自来水冲洗几分钟，0.2%碱性酒精几秒钟，自来水冲洗，常规酒精脱水，二甲苯透明，封片。

3.5 HE染色：冷冻切片从冰箱取出，贴在经多聚赖氨酸处理的玻片上，自然干燥，用蒸馏水洗涤1～2 s，然后用Harris苏木精(60℃)染色30～60 s，用流动水洗涤5～10 s，然后分化。用1%盐酸乙醇洗1～3s，用水洗1～2 s，蓝色促进液(即氢氧化铵溶液)返回蓝色5～10 s，流动水冲洗15～30 s，伊红染色30～60 s，显微镜下观察颜色变化，用蒸馏水洗涤1～2 s，用梯度乙醇脱水，用二甲苯透明干燥，用中性胶密封。

3.6 免疫组化染色：冰冻切片展开贴于多聚赖氨酸处理过的载玻片上,干燥，和抗体孵育，一抗NF-κB(p65)、一抗IκBа抗体，4 ℃过夜或37 ℃ 60 min，最后DAB显色，封片。

结果

1 脑灵汤对Alzheimer’s disease模型大鼠行为学的影响 为了证实脑灵汤对Alzheimer’s disease模型大鼠的保护作用，首先我们运用Y迷宫实验和Morris水迷宫实验检测脑灵汤对Alzheimer’s disease模型大鼠行为学的影响。实验结果表明：Y迷宫实验中，模型组大鼠所需要的电刺激次数较正常和假手术组明显增加(P<0.05)，与模型组比较，脑灵汤组所需要的电刺激次数更少(P<0.05),见表1；在Morris水迷宫实验中，模型组进行隐匿平台搜索实验所需的时间显著长于正常组和假手术组(P<0.05)，而在探索实验中，穿越平台的大鼠数量显著多于正常组和假手术组(P<0.05)。模型组高于正常组和假手术组(P<0.05)。脑灵汤组隐匿平台搜索时间明显短于模型组(P<0.05)，穿越平台次数明显多于模型组(P<0.05),见表2。可见平台实验各组数据无明显差异(数据未列出)。通过行为学实验说明与模型组相比，脑灵汤组的记忆和学习能力改善。

表1 各组大鼠Y迷宫实验的学习记忆成绩比较(次)

注：与正常组比较，★P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05

表2 Morris水迷宫实验结果

注：与正常组相比，★P<0.05；与模型组相比，▲P<0.05

2 脑灵汤对Alzheimer’s disease模型大鼠老年斑的影响 行为学实验已经验证脑灵汤对Alzheimer’s disease模型大鼠有保护作用，接下来应用刚果红染色观察老年斑沉积情况(图1)，结果显示模型组大鼠海马CA3区可见橘红色Aβ沉积，证明本实验模型成功诱导了AD大鼠病理模型，而经过脑灵汤干预后，脑灵汤组大鼠海马CA3区未见Aβ沉积，海马齿状回背侧细胞排列整齐,无明显的神经元缺失。

3 脑灵汤对Alzheimer’s disease模型大鼠组织细胞形态的影响 继续通过HE染色观察脑灵汤对Alzheimer’s disease模型大鼠组织细胞形态的影响(图2)。HE染色结果显示正常组海马细胞层清晰，形态规则有序，排列整齐致密，核清晰可见，染色均匀，呈淡蓝色或蓝色。模型组海马CA3区细胞排列紊乱，细胞间隙变宽，细胞层不完整，胞体结果不完整。胞体变小、胞浆色淡、胞核变小，染色很淡甚至消失；脑灵汤组大鼠海马CA3区细胞形态、层次结果均较模型组好转。

图1 各组大鼠海马CA3区老年斑沉积情况 (刚果红染色，×200)

图2 各组大鼠海马CA3区细胞形态改变的情况(HE染色，×400)

4 脑灵汤对Alzheimer’s disease模型大鼠NF-κB和IκB的影响 见表3～4。以上证实脑灵汤对Alzheimer’s disease模型大鼠行为学和形态学均有保护作用，而其具体作用机制并不十分清楚，通过查阅文献发现，发现淫羊藿苷、红景天苷均能抑制炎症反应的发生[2-3]，因此我们推测脑灵汤可能通过影响炎症反应而达到对Alzheimer’s disease模型大鼠得多保护作用，采用免疫组化染色观察NF-κB和IκB蛋白的表达情况。免疫组化染色结果(图3、4)显示模型组海马CA3区NF-κB阳性细胞数显著高于正常组和假手术组(P<0.05)，而IκB阳性细胞数显著低于正常组和假手术组(P<0.05)。脑灵汤组海马CA3区NF-κB阳性细胞数明显低于模型组(P<0.05)。IκB阳性细胞数明显高于模型组(P<0.05)。

表3 各实验组大鼠海马CA3区NF-κB免疫反应比较

注：与正常组相比，★P<0.05；与模型组相比，▲P<0.05

表4 各实验组大鼠海马CA3区IκB免疫反应比较

注：与正常组相比，★P<0.05；与模型组相比，▲P<0.05

图3 各组大鼠NF-κB表达结果 (免疫组化染色，×200)

图4 各组大鼠IκB表达结果(免疫组化染色，×400)

讨 论

目前所知，AD作为神经退行性疾病之代表，其最显著的影像学标记是大脑的渐进性萎缩。更深层次的病理改变，则是脑组织内的β淀粉样蛋白增多形成的血管壁淀粉样变性，继而引起的老年斑和神经元纤维缠结(细胞外)。因此，一直以来，β淀粉样蛋白成为解释各种AD发病学说与药理作用原理的公认途径之一。随着炎症发病学说的兴起，越来越多的证据表明AD的神经炎症和神经元功能障碍之间存在联系，这种联系是由小胶质细胞和星形胶质细胞的逐渐激活以及由此产生的促炎症反应的分子过度生成所协调的，同时释放抗炎介质对抗炎症过程，导致AD病理的发生[5]。AD患者反应性小胶质细胞增生与神经炎症被认为是斑块沉积的后果[6]。于是，国内外学者对于未活化的小胶质细胞与AD炎症病变的关系产生了许多新的认识，最终得出早期炎症反应指标是AD以后发展的危险因素[7]。

对于AD的治疗，受限于病因，既往通过促进神经细胞的再生、延缓脑细胞的老化、基因改进等方法做对因治疗，均处于理论上的探讨或实验阶段，至今没有突破性发现。有研究显示[8]，通过对200多例AD患者的随访，采用MMSE随访评测，随访时间2～3年以上，结果显示，给予AD患者多靶点全面治疗可以让病情基本稳定。目前所见，AD多靶点治疗方案有：胆碱酶抑制剂AchEI 及NMDA受体拮抗剂；针对抑郁、淡漠、焦虑等精神症状，应用SSRI类药物治疗等。因此在疗效欠佳且费用昂贵的同时，我们发挥中药复方多靶点治疗的作用，探讨中药复方对AD的防治作用及机制更有积极意义与经济价值。

AD属于中医学“呆症”、“郁症”范畴，其发病的核心机理也不外虚实夹杂、本虚标实。限于古人的解剖水平与科技能力，古籍文献所见关于“呆症”、“郁症”致病原因论述繁多，病理机制颇为复杂。古代与现代中医学家对于“呆症”、“郁症”的治疗手段丰富，但总体围绕先天(肾)后天(脾)，或水(肾)火(心)既济模型开展，通过涤痰开窍、活血通络等方法影响人体气血津精液的生化功能为主体。具体方法，除了中药复方外，还见有配合针灸、推拿、按摩、药膳等辅助治疗。就AD证型而言，主要是对机体内气、血、痰、瘀、毒等物质对脏腑气化功能的影响程度，分别对应气虚、血虚、血瘀、痰浊和火毒等[9]；发病部位主要涉及五脏兼六腑；但是AD患者往往不是单一器官受损，而是同时多个器官受损。同样有研究[10]显示，应用益智治呆方对脾肾两虚型老年性痴呆患者有保护作用，益智治呆方能有效的提高患者的认知功能和活动能力。张利平等研究表明[11]清心益智汤能够有效提高AD患者的认知水平和生活质量，对AD患者血清中SOD、MDA、T-AOC、ox-LDL的表达水平有明确的改善作用。本研究所用组方，包括淫羊藿、红景天、何首乌、白参等中药，其功能为补肾益气填髓、活血开窍祛痰。其中，淫羊藿为临床较常用中药，因能改善生殖功能故名。《神农本草经》明确记载淫羊藿具有补肾健脑之效。大量的实验研究表明，淫羊藿提取物淫羊藿苷能够进入大脑组织，具有减轻炎症、抗氧化应激、减少淀粉样蛋白(Aβ)生成及改善AD患者的认知障碍功能等作用[12]，其靶点可能是通过SIRT 6蛋白和NF-κB蛋白表达的抑制和从而使炎性细胞因子产生减少[13]。红景天中红景天苷可通过下调巨噬细胞内NF-κB和转化生长因子β1(TGF-β1)信号转导途径表达抑制炎性细胞因子的释放，同时抑制高糖诱导的系膜细胞增殖[14]。此外，红景天苷抑制了红景天苷对NF-κB/TGF-β1信号通路从而抑制哮喘小鼠气道重塑[15]。另外，何首乌中生物活性提取物首乌二苯乙烯苷(TSG)具有升高海马和皮层胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性，可能的原因包括，通过降低皮层AchE活性[16]，改善主动学习能力和被动回避记忆能力。

本研究观察了脑灵汤对Aβ1 - 42诱导的AD模型大鼠的保护作用，并通过观察炎症反应的重要起始蛋白NF -κB/IκB来探讨其机制。我们首先通过行为学实验发现，模型组大鼠在Y-迷宫实验中所需要的电刺激次数较正常和假手术组明显增加，脑灵汤组在电刺激Y-迷宫实验成绩考察较模型组优异；脑灵汤组大鼠Morris水迷宫实验过程中搜索所需时间较模型组少。以刚果红染色作为形态学观察指标，脑灵汤组海马CA3区未见特征性显示；以HE染色作为形态学观察指标，模型组大鼠海马CA3区染色所见，除了细胞排列混乱外，胞体变小、胞浆色淡、胞核变小，染色很淡甚至消失；脑灵汤组大鼠海马CA3区细胞形态、层次结果均较模型组好转。总之，行为学和形态学的实验证明脑灵汤对AD模型大鼠具有保护作用。至于NF-κB和IκB的表达情况，脑灵汤组海马CA3区NF-κB阳性细胞数较模型组明显减少，而IκB阳性细胞数较模型组明显增加。显然，NF-κB表达的下降和IκB表达的升高与AD的发病进展密切相关。至于机理，我们初步推测脑灵汤可能够通过抑制NF-κB的活性增强AD大鼠对炎性因子敏感性，IκB阳性细胞数增加抑制了NF-κB的表达，进一步抑制炎症的发生和发展。

总而言之，脑灵汤基于补肾添髓、活血通络、祛痰开窍法而制，通过抑制炎症反应而减少Aβ淀粉样蛋白的沉积从而保护AD模型大鼠，但本研究仅从蛋白水平证明，缺乏更进一步研究，接下来将寻求更精准靶点，为防治AD提供思路。