三参生血颗粒对60Co照射所致C57BL/6小鼠造血及免疫系统不良反应治疗作用的研究*

刘文秀，杨 娟，曹 博，高 院，徐红维

1.延安大学附属医院放射科(延安 716000)；2.陕西省延安市人民医院肺病科(延安 716000)；3.西安凤城医院影像科(西安 710016)

恶性肿瘤的放射治疗时，放疗射线在对肿瘤病灶进行直接杀伤作用的同时，还可对正常组织产生较强影响，造成机体出现一系列应激变化,引起体内氧自由基含量增高,最终导致造血及免疫系统出现损伤，严重影响患者的生命健康[1-2]。因此，如何对放疗所致造血及免疫系统损伤进行有效的治疗是临床迫切需要解决的重大课题[3]。三参生血颗粒是我院在长期的临床观察基础上，由多位名老中医共同拟定的抗肿瘤辅助方剂，笔者观察了三参生血颗粒对60Co照射所致C57BL/6小鼠造血及免疫系统不良反应的治疗作用，现报告如下。

材料与方法

1 动物与分组方法 50只6周龄雄性C57BL/6雄性小鼠，均购买于陕西中医学院药学院实验动物中心，体质量范围均为18 g～22 g，平均体质量(20.2±2.1)g，实验动物许可证号：SCXK(陕)2017-0198。本研究动物实验均于二级动物室中开展，实验动物均进行为期7 d的适应性喂养后方可使用，动物房相对湿度保持在45%～70%，温度保持在20℃～25℃，12 h昼夜，使用空气净化系统，并保持门窗密闭，送风机每隔3 d换滤网1次。饲料及垫料均通过60Co照射处理后使用，每天对动物房地面、墙壁及笼具架进行清扫，采用紫外线消毒1次。实验完成后，对处死小鼠的尸体及实验垃圾进行及时清理与焚烧。将上述小鼠随机分为模型组、空白组、高剂量三参生血颗粒治疗组(简称高剂量组)、中剂量三参生血颗粒治疗组(简称中剂量组)及低剂量三参生血颗粒治疗组(简称低剂量组)，每组10只。

2 药 品 三参生血颗粒由我院药学部中药与天然药物制剂中心研究制备并提供，配方：丹参、人参、党参各20 g，黄芪、生熟地、当归、鸡血藤、阿胶各10 g，菟丝子5 g，以水煎煮后用蔗糖及淀粉作为辅料进行制粒，每剂制备成15 g的颗粒剂；产品批号：2017011091；规格：15 g/袋；临床用量为1次/d，1袋/次，折合生药量为17.47 g。依据文献[4]中实验动物与人体给药剂量的换算公式，确定本研究中小鼠的剂量，即小鼠剂量(mg/kg)=成人剂量(mg/kg)×12.3，成人体质量以60 kg计，故三参生血颗粒的正常人体剂量为15 g/60 kg=0.25 g/kg，折合每只小鼠正常剂量为0.25 g/kg×12.3=3.075 g/kg，故笔者设置正常治疗剂量(3.075 g/kg)为中剂量组的给药剂量，设置两倍的正常治疗剂量(6.15 g/kg)为高剂量组的给药剂量，设置0.5倍的正常治疗剂量(1.5375 g/kg)为低剂量组的给药剂量。

3 仪 器 BV767型紫外可见光分光光度计(安徽奥普勒仪器有限公司)，NHJ-5216K型血细胞分析仪(日本Nihon Kohoden公司)，CC-8型流式细胞仪(BD Biosciences公司)，BT-9u型高速离心机(美国安达利公司)；60Co照射采用AXESSE型医用电子直线加速器(瑞典ELEKTA公司生产)。

4 造模及处理方法[5]采用60Co放射源对模型组、高剂量组、中剂量组及低剂量组小鼠进行全身照射1次，照射剂量4.5 Gy、照射距离80 cm、照射时间2 min。照射完成后，对各组小鼠进行给药处理，其中高剂量组、中剂量组及低剂量组小鼠分别灌胃给予6.15 g/kg、3.075 g/kg及1.5375 g/kg的三参生血颗粒，空白组及模型组则给予等量生理盐水，连续给药15 d。

5 指标检测 ①血象指标含量检测：末次给药24 h后，采用尾静脉取血法取各组小鼠静脉血，检测其中血象指标含量[红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)及血红蛋白(Hgb)]。②氧化应激指标检测：取一部分上述静脉血，分离血清，检测其中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)及过氧化氢酶(CAT)含量。③免疫功能指标检测：取一部分上述静脉血，采用流式细胞仪检测其中CD3+及CD4+含量，采用化学发光法检测其中IgG、IgA及IgM含量。④计算胸腺和脾脏指数：取血完成后，采用颈椎脱臼法将各组小鼠处死，取小鼠胸腺和脾脏，计算胸腺和脾脏指数，其中胸腺指数=(胸腺重量/体质量)×1000，脾脏指数=(脾脏重量/体质量)×1000。⑤骨髓象指标检测：取小鼠胸骨，选择中间最红的骨髓，用止血钳将其挤出滴落于预先滴有小牛血清的清洁载玻片上，混匀、推片、固定、晾干，并用新鲜配制的Giemsa染液染色。染色完成后，在镜下观察，计数1000个嗜多染红细胞中微核数，并统计骨髓嗜多染红细胞微核率(‰)。另取小鼠股骨，采用7号针头将股骨末端刺穿，并用10 ml磷酸盐缓冲液冲洗骨髓，取4号针头将冲出的骨髓液过滤待用，取0.5 ml骨髓液滴至血细胞计数板上，利用显微镜下观察有核细胞数，其中有核细胞数(×107个/L)=稀释倍数×4个大方格有核细胞总数÷4×104。

结果

1 三参生血颗粒对小鼠血象指标的影响 见表1。与模型组比较，高剂量组、中剂量组及低剂量组小鼠RBC、WBC、PLT及Hgb含量均显著降低(P<0.05)。与空白组比较，高剂量组、中剂量组及低剂量组小鼠RBC、WBC、PLT及Hgb含量均显著增高(P<0.05)。

2 三参生血颗粒对小鼠免疫功能指标的影响 见表2。与模型组比，高剂量组、中剂量组及低剂量组小鼠CD3+、CD4+、IgG、IgA及IgM含量均显著增高(P<0.05)。与空白组比，高剂量组、中剂量组及低剂量组小鼠CD3+、CD4+、IgG、IgA及IgM含量均显著降低(P<0.05)。

表1 三参生血颗粒对小鼠血象指标的影响

注：与模型组比较，*P<0.05；与空白组比较，#P<0.05

表2 三参生血颗粒对小鼠免疫功能指标的影响

注：与模型组比较，*P<0.05；与空白组比较，#P<0.05

3 三参生血颗粒对小鼠胸腺和脾脏指数的影响 见表3。与模型组比，高剂量组、中剂量组及低剂量组小鼠胸腺和脾脏指数均显著增高(P<0.05)。与空白组比，高剂量组、中剂量组及低剂量组小鼠胸腺和脾脏指数均显著降低(P<0.05)。

表3 三参生血颗粒对小鼠胸腺和脾脏指数的影响 (%)

注：与模型组比较，*P<0.05；与空白组比较，#P<0.05

4 三参生血颗粒对小鼠骨髓象指标的影响 见表4。与模型组比，高剂量组、中剂量组及低剂量组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率均显著降低，而有核细胞数均显著增高(P<0.05)。与空白组比，高剂量组、中剂量组及低剂量组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率均显著增高，而有核细胞数均显著降低(P<0.05)。

表4 三参生血颗粒对小鼠骨髓象指标的影响

注：与模型组比较，*P<0.05；与空白组比较，#P<0.05

5 三参生血颗粒对小鼠氧化应激指标的影响 见表5。与模型组比，高剂量组、中剂量组及低剂量组小鼠MDA均显著降低，而SOD、GSH-PX及CAT均显著增高(P<0.05)。与空白组比，高剂量组、中剂量组及低剂量组小鼠MDA均显著增高，而SOD、GSH-PX及CAT均显著降低(P<0.05)。

表5 三参生血颗粒对小鼠氧化应激指标指标的影响

注：与模型组比较，*P<0.05；与空白组比较，#P<0.05

讨论

放射治疗是恶性肿瘤治疗的主要方法，然而该治疗方法不仅可有效杀灭肿瘤细胞，对于正常组织及器官亦可造成严重损伤，引起一系列毒副作用，直接影响到患者的治疗效果及生存质量[6-7]。研究结果表明，放射射线可造成机体大量释放自由基,而自由基反应可激活细胞因子网络及炎症介质,形成类似于代偿性抗炎反应综合征及全身炎症反应综合征的病理生理改变,从而对非照射区域及远隔部位的组织、器官功能产生严重影响[8-9]。造血系统及免疫系统是放射性损伤的高敏感系统，放射线不仅可以抑制红系祖细胞、粒系祖细胞及造血干细胞的增殖能力，还可降低机体的体液及细胞免疫功能，最终引起免疫功能降低、外周血细胞数下降、微循环障碍、骨髓造血系统功能障碍及造血微环境破坏等病理反应[10-11]。因此，改善放射所致造血及免疫系统损伤在提高放射治疗效果，改善患者生活质量，提高治疗耐受性等方面均具有重要意义[12-13]。本研究中，C57BL/6小鼠经放射线照射后，全部小鼠均成功造模且未出现小鼠死亡，这表明本研究中所建立的小鼠模型是放射性损伤治疗药物研究的理想模型。

三参生血颗粒是我院常用的院内制剂，主要组成药材包括丹参、党参、人参、黄芪、生熟地、当归、阿胶、菟丝子、鸡血藤等，方中丹参活血补血；党参善补中气，以养后天；人参益气活血；黄芪为治诸气虚之要药；生熟地补阴养血；当归补血活血；阿胶补肾益阴；菟丝子补肾阳，益肾阴，以阳护阴；鸡血藤活血化瘀，诸药共奏益气养阴、活血化瘀、生血补血等功效[14-15]。我院多年实践证实，该方剂用于提高癌症患者免疫功能、提高患者生活质量等方面具有较好应用价值，尤其是对于晚期癌症患者化疗所致毒副作用具有较好的改善作用，但目前尚缺乏对该药物的药理作用的基础性研究，而对于其是否可对放射治疗所致不良反应具有较好的改善作用亦有待证实。鉴于此，笔者观察了三参生血颗粒对60Co照射所致C57BL/6小鼠造血及免疫功能的影响，期望为该药物的临床新应用提供一定的借鉴。

综上所述，三参生血颗粒对60Co照射所致C57BL/6小鼠造血及免疫系统不良反应具有较好的治疗作用，其主要机制可能与该药物的抗氧化应激作用密切相关。然而笔者对于三参生血颗粒的具体作用机制的探讨仍不够深入，对于药物的物质基础尚未进行研究，故在后期研究中还应对该药物的详细作用机制及物质基础探讨进行深入阐述。