利福昔明经TRPV1-VGLUT2/3通路影响大鼠内脏敏感性的研究*

杨长青 郭晓姝 李 季 赵 莉 赵甘婷 盛淑婷 魏子白

长治医学院附属和平医院消化科(046000)

背景：利福昔明可明显缓解肠易激综合征患者的腹痛，但机制不明。目的：探讨利福昔明对大鼠内脏敏感性的影响及其作用机制。方法：建立慢性避水应激大鼠模型，并将大鼠分为对照组、模型组和利福昔明组。行肌电图评估大鼠内脏敏感性，免疫荧光法检测L6S1 DRG中TRPV1、VGLUT2/3免疫活性，蛋白质印迹法检测L6S1段脊髓中TRPV1、VGLUT2/3蛋白表达，行16S rDNA菌群测序分析。结果：慢性避水应激能诱导大鼠内脏敏感性增高，L6S1 DRG中TRPV1、VGLUT2/3免疫活性明显增高，L6S1段脊髓中TRPV1、VGLUT2/3蛋白表达明显增高，肠道菌群发生紊乱。给予利福昔明后，内脏敏感性明显降低，L6S1 DRG中TRPV1、VGLUT2/3免疫活性明显降低，L6S1段脊髓中TRPV1、VGLUT2/3蛋白表达明显降低，肠道菌群紊乱明显改善。TRPV1拮抗剂可明显降低VGLUT2/3免疫活性。结论：利福昔明通过肠道菌群和TRPV1-VGLUT2/3通路改善应激诱导的大鼠内脏高敏感。

肠易激综合征(IBS)是消化科门诊的常见病，全世界发病率为10%～20%[1]。患者表现以腹痛为主并伴排便习惯改变，但腹痛症状目前尚无有效的治疗方法，研究显示内脏高敏感可能是引起腹痛的主要原因之一[2]。

利福昔明是一种肠道非吸收性抗菌药物，能改变大鼠回肠的细菌种类，导致乳酸杆菌增加，从而预防慢性心理应激诱导的内脏高敏感[3]。利福昔明已被FDA批准用于IBS患者的治疗，可有效改善腹痛症状[4]，但其具体作用机制尚未完全阐明。

有研究[5]结果显示瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1)参与内脏高敏感的形成。囊泡谷氨酸转运体-3(vesicular glutamate transporter 3, VGLUT3)参与结直肠扩张(CRD)诱导的内脏痛觉转导过程，旋毛虫一过性肠道感染可引起外周和中枢神经VGLUT3表达增加，参与内脏高敏感的形成[6]。目前尚未见利福昔明是否通过肠道菌群和TRPV1-VGLUT3通路诱导内脏高敏感的报道。本研究通过制备慢性避水应激(water avoidance stress, WAS)动物模型，并检测背根神经节(DRG)和脊髓TRPV1、VGLUT2/3表达以及评估肠道菌群情况，旨在探讨利福昔明改善IBS腹痛的可能机制，从而为利福昔明改善IBS患者腹痛症状提供新的理论基础。

材料与方法

一、实验动物

成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只，体质量200～250 g，在标准条件下饲养。所有实验程序均经长治医学院动物伦理委员会批准。

二、方法

1.动物分组和模型制备：大鼠随机分为WAS组、对照组和利福昔明组，每组各6只。将大鼠置于盛有水(25 ℃)的有机玻璃槽中央的玻璃板上，水平面低于玻璃板1 cm。限制大鼠活动，每天1 h，连续10 d，以制备慢性WAS模型。对照组玻璃槽中无水。利福昔明组大鼠先灌胃利福昔明(150 mg/kg，Sigma)，2次/d，连续10 d，然后行慢性WAS实验。

2.内脏运动反应检测和肌电图分析：检测前禁食24 h，乙醚轻度麻醉动物，将直径为2 mm的一次性导尿管气囊由肛门插入远端结肠，球囊近端距肛门2 cm，以医用胶布将导管与大鼠尾部固定。将大鼠置入透明有机玻璃固定盒中，苏醒后适应10 min，首次使用0.1 mL扩张球囊10 s，间隔5 min后使用0.2 mL的球囊进行扩张(以后容积每次增加0.1 mL)。使用放置在腹部肌肉的同心圆电极记录信号，以BL-420生物机能实验系统收集并分析信号。

3.免疫荧光法：L6S1的DRG取材后置于4%多聚甲醛液，4 ℃过夜，包埋，切片，固定组织。置于1% Triton X-100中浸泡2 h，以3%过氧化氢消除内源性过氧化酶15 min。PBS洗涤，封闭。加入购自Abcam公司的兔抗TRPV1(工作浓度为1∶200)、鼠抗VGLUT2(工作浓度为1∶1 000)和兔抗VGLUT3(工作浓度为1∶200)4 ℃孵育过夜；加入购自Abcam公司的荧光标记的二抗羊抗兔(工作浓度为1∶2 000)和羊抗鼠(工作浓度为1∶2 000)37 ℃孵育30 min。DAPI封片后于激光共聚焦显微镜下采集图像并行定量检测分析。

为观察L6S1 DRG中TRPV1与VGLUT2/3的相关性，6只大鼠行CRD前15 min神经鞘内预注射TRPV1拮抗剂SB366791(100 μmol/L，美国Selleck公司)，6只大鼠注射0.9%NaCl溶液作为对照组，观察两者的荧光活性。

4.蛋白质印迹法：将大鼠麻醉后处死，快速分离L6S1段脊髓，-80 ℃保存。取各组组织，提取蛋白质，调整各样本蛋白总量，行10% SDS-PAGE电泳，分离蛋白后电转移至PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，加入兔抗TRPV1(工作浓度为1∶500)、鼠抗VGLUT2(工作浓度为1∶1 000)、兔抗VGLUT3(工作浓度为1∶500)、β-actin(工作浓度为1∶1 500)(均购自英国Abcam公司)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，再分别与HRP标记的羊抗鼠和羊抗兔二抗(工作浓度为1∶1 000)室温避光孵育1 h，染色条带曝光显影，以目的条带与β-actin的比值作为目的蛋白的表达。

5.16S rDNA序列分析：大鼠新鲜粪便采用QIAamp快速DNA粪便试剂盒(Qiagen)分离微生物基因组DNA，对DNA的16S V3～V4区进行PCR扩增。正向引物：5’-ACT CCT ACG GGR SGC AGC AG-3’，反向引物：3’-GGA CTA CVV GGG TAT CTA ATC-5’。以稀释后的基因组DNA为模板，使用KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR试剂盒(罗氏公司)高保真酶进行PCR，确保扩增的准确性和高效性。使用Illumina HiSeq 2500进行上机测序。

三、统计学分析

结 果

一、内脏敏感性

扩张容积为0.1、0.4 mL时，各组间EMG相比无明显差异(P>0.05)。扩张容积为0.2、0.3 mL时，WAS组EMG均显著高于对照组(P=0.000；P=0.004)，利福昔明组又显著低于WAS组(P=0.015；P=0.005；图1、表1)。

二、TRPV1和VGLUT2/3免疫活性

免疫荧光法显示，与对照组相比，WAS组大鼠L6S1 DRG中TRPV1和VGLUT2/3免疫活性信号明显增强(P=0.03;P=0.013;P=0.01)；与WAS组相比，利福昔明能明显减少TRPV1和VGLUT2/3的免疫活性信号(P=0.006;P=0.007;P=0.018；图2、表2)。

以TRPV1拮抗剂预处理后，大鼠L6S1 DRG中VGLUT2/3免疫活性明显降低(VGLUT2: 191.33±29.12对132.72±13.04,P=0.014; VGLUT3: 46.78±12.68对27.22±5.94,P=0.025；图3)。

三、TRPV1和VGLUT2/3蛋白表达

蛋白质印迹法显示，与对照组相比，WAS组L6S1段脊髓中TRPV1和VGLUT2/3蛋白表达明显增加(P=0.02;P=0.02;P=0.02)。与WAS组相比，利福昔明组TRPV1和VGLUT2/3蛋白表达明显减少(P=0.02;P=0.04;P=0.03；表3、图4)。

四、肠道菌群分析

利福昔明组、WAS组和对照组大鼠肠道菌群的主要类型分别为Spirochaetaies、Bacillales和Anaero-truncus(图5A)。在属水平上，Treponema、Alistipes、Bifidobacterium、Anaerotruncus和Gemella对三组大鼠肠道菌群的影响较大。与对照组相比，WAS组和利福昔明组在属水平上Treponema和Alistipes的相对丰度明显下降(P<0.05；图5B)。Alpha多样性分析结果显示，与对照组相比，WAS组Shannon指数明显降低(4.28±0.38对6.19±0.35,P=0.002 7)；利福昔明组显著高于WAS组(5.99±0.29对4.28±0.38,P=0.001)。

图1 各组CRD后内脏运动反射的肌电活性

表1 各组大鼠CRD后内脏运动反射的肌电活性

*与对照组比较，P<0.05；#与WAS组比较，P<0.05

图2 各组大鼠L6S1 DRG中TRPV1和VGLUT2/3的免疫荧光活性

图3 TRPV1受体拮抗剂对大鼠L6S1 DRG中TRPV1和VGLUT2/3免疫荧光活性的影响

表2 各组大鼠TRPV1和VGLUT2/3免疫活性

*与对照组比较，P<0.05；#与WAS组比较，P<0.05

表3 各组大鼠TRPV1和VGLUT2/3蛋白表达

*与对照组比较，P<0.05；#与WAS组比较，P<0.05

*P<0.05

讨 论

肠道菌群在大鼠内脏痛觉过敏中起有关键作用，本研究结果表明慢性WAS诱导的肠道菌群紊乱会导致周围和中枢神经元TRPV1-VGLUT2/3通路激活，从而导致内脏痛觉过敏，抗菌药物利福昔明能改善WAS所致的大鼠内脏高敏感。

腹痛是IBS患者常见的症状之一，内脏痛觉过敏是引起腹痛的重要因素之一，可引起从肠道到大脑的信号被夸大。本研究中，当扩张容积分别为0.2 mL和0.3 mL时，WAS组的肌电活动较对照组明显增加，给予利福昔明后可明显降低应激引起的肌电活动。说明即使轻度刺激也能引起WAS大鼠内脏痛觉，利福昔明主要作用是能提高引起WAS的痛觉阈值。但当扩张容积超过0.4 mL时，各组间肌电活性无明显差异。

肠道菌群是一个庞大的生态系统，在人体中发挥多种功能。研究表明肠道菌群在调节肠道功能中起有重要作用，IBS患者与健康组肠道菌群存在显著差异[7]。近年研究表明益生菌对IBS患者有一定的疗效[8-9]。利福昔明已被FDA批准用于IBS的治疗，可有效改善腹痛[4,10]。本研究中，与对照组相比，WAS组和利福昔明组在属水平上Treponema和Alistipes菌的相对丰度明显下降。利福昔明对应激大鼠肠道菌群相对丰度的作用还应增加样本数行进一步研究证实。

细菌可通过不同的机制在痛觉感受器神经元中触发钙通道和动作电位。罗伊杆菌(DSM 17938)可降低辣椒素和空肠脊髓神经动作电位扩张诱发的激发反应，其中80%的反应被TRPV1通道拮抗剂所阻断[11]。肠道菌群紊乱会改变结肠初级传入神经元中的神经递质，从而导致内脏直觉的改变。有研究发现，TRPV1是新霉素的靶点，腹腔内新霉素给药可抑制内脏痛觉[12]。VGLUT2主要在痛觉初级传入神经元中起主导作用[13]。在神经元末梢中VGLUT3能将胞质中的神经递质谷氨酸逆浓度转运至囊泡。在DRG中，TRPV1和VGLUT3阳性神经元均为C-和Aδ-类纤维。在DRG、脊髓以及大脑黑质、海马中，辣椒素能增加突触前Ca2+释放，增强突触前TRPV1的活性和谷氨酸的释放[14-15]。研究显示，VGLUT3可能与机械和内脏痛觉过敏密切相关[6]。研究还表明，VGLUT2在TRPV1热痛觉过敏中发挥重要作用[14]。本研究结果显示，WAS大鼠TRPV1和VGLUT2/3表达显著增加，而利福昔明可抑制其升高。给予TRPV1拮抗剂后，大鼠外周神经元VGLUT2/3显著降低。因此，推测肠道菌群失衡可激活TRPV1通道，从而诱导VGLUT2/3释放神经递质谷氨酸，导致大鼠内脏痛觉过敏。

图5 各组肠道菌群差异分析

总之，利福昔明可能是通过肠道菌群和TRPV1-VGLUT2/3通道来改善大鼠内脏高敏感，但该研究结论仍需行进一步研究证实。