Claudin-2在胆固醇结石形成过程中的作用及其机制研究*

陈 跃 冯亚东 赵向阳

南京市溧水区人民医院消化科(东南大学附属中大医院溧水分院)1(211200) 东南大学附属中大医院消化科2

背景：Claudin蛋白家族是构成细胞紧密连接的重要分子，其中claudin-2是一种在肝细胞和胆管细胞中高表达的细胞旁通道形成蛋白，具有水分子和阳离子的选择渗透性，在消化和泌尿系统中发挥至关重要的生理调控作用。目的：探讨claudin-2在胆固醇结石形成和胆汁分泌过程中的作用及其机制。方法：收集claudin-2基因敲除(Cldn-2-/-)小鼠和野生型(Cldn-2+/+)小鼠的肝脏和胆囊组织，以蛋白质印迹法检测claudin蛋白家族的表达，HE染色、免疫荧光染色和电镜观察敲除claudin-2基因对肝脏和胆囊组织结构的影响。并分析claudin-2蛋白对胆汁成分和流速的调控作用。结果：Claudin家族蛋白在Cldn-2+/+小鼠肝脏和胆囊组织中高表达。与Cldn-2+/+小鼠相比，Cldn-2-/-小鼠肝脏和胆囊组织结构无明显差异，胆汁流速明显降低(P<0.05)，胆汁浓度明显增加(P<0.05)，肝脏和胆囊胆汁中的胆汁酸、胆固醇、胆红素、磷脂含量显著增加(P<0.05)。结论：Claudin-2蛋白通过调控胆汁成分和细胞紧密连接中的水分子旁分泌过程，影响胆汁的形成，这一过程的失调显著增加了小鼠对胆固醇结石相关疾病的易感性。

胆石症是消化系统的常见疾病，我国的发病率高达10%～15%，并呈逐年上升的趋势[1]，但对胆石症尤其胆固醇结石形成的具体机制缺乏深入的研究。有研究发现，在胆汁成核作用开始，到脂质转化、囊泡破坏和融合直至胆固醇单水结晶形成的过程中，成核因子和抑成核因子在多个水平上调控胆固醇的成核作用[2]，寻找关键的成核因子和抑成核因子是遏制胆固醇结石形成的重要突破口。

Claudin-2是第一个发现的通道形成蛋白，具有水分子和阳离子的选择渗透性，在消化和泌尿系统中发挥至关重要的生理调控作用[3-4]。Claudin-1、-2、-3蛋白在肝脏和胆管系统中广泛分布，claudin-1基因的功能障碍会导致胆汁渗漏、肝内胆汁淤积和肝细胞损伤，形成硬化性胆管炎[5]。目前尚无关于claudin-2基因在胆囊结石致病机制中的报道，但其功能可能与claudin-1类似，在胆管结石的形成过程中发挥重要的生理调控作用。本研究通过评估敲除claudin-2基因对小鼠肝脏和胆囊组织结构的影响，以及对胆汁成分和流速的调控作用，旨在探讨claudin-2在胆固醇结石形成和胆汁分泌过程中的作用及其机制，从而为临床治疗胆囊结石寻找潜在靶点。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

1.实验动物：20只SPF级claudin-2基因缺失(Cldn-2-/-)C57BL/6小鼠和20只claudin-2野生型(Cldn-2+/+)小鼠购自上海南方模式生物科技股份有限公司，体质量20～25 g。由东南大学附属中大医院动物实验中心饲养并稳定建系传代。所有动物实验方案通过东南大学附属中大医院动物研究伦理委员会批准。

2.主要实验试剂：兔抗claudin-1、-2、-3抗体(Invitrogen，Life Technologies)，Alexa-488标记的抗兔IgG以及Alexa-546标记的抗鼠IgG抗体(Molecular Probes)。

二、实验方法

1.实验分组和组织标本的获取：Cldn-2+/+小鼠和Cldn-2+/+小鼠喂食胆固醇结石诱石饲料4周。所有实验小鼠于术前禁食12 h，戊巴比妥(4.5 mg/100 g剂量)腹腔注射麻醉，采用腹部正中切口，暴露胆囊，观察有无结石并收集部分胆汁进行胆汁成分分析，结扎胆囊管切除胆囊于液氮冻存，同时采集肝脏组织-80 ℃保存。

2.HE和免疫荧光染色：取肝脏和胆囊组织，以甲醛溶液固定，石蜡包埋后切片行常规HE染色，光学显微镜下分析肝脏和胆囊组织形态学变化。另取部分液氮冷冻的肝脏和胆囊组织进行切片，修复抗原，清除内源性过氧化物酶活性，血清封闭，滴加claudin-1、-2、-3免疫荧光抗体(工作浓度1∶750)4 ℃孵育过夜，室温下孵育二抗2 h，封片。光学显微镜下观察免疫荧光染色结果。

3.胆汁流量测量：小鼠自由饮水、禁食4 h后戊巴比妥腹腔注射麻醉，剖腹分离胆总管后插入塑料引流管并结扎固定，待流量稳定后连续观察4 h，测定每小时胆汁流量和流速，并收集部分胆汁进行胆汁成分分析。

4.蛋白质印迹法检测肝脏组织claudin蛋白家族的表达情况：取100 mg肝脏组织，低温研磨，充分裂解后获取蛋白上清，以Bradford法进行蛋白定量。取40 μg蛋白样品，行10% SDS-PAGE电泳，半干转至硝酸纤维素膜，37 ℃封闭液中封闭2 h；分别加入claudin-1、-2、-3抗体(工作浓度为1∶500)4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗膜3次后，加入相应二抗(工作浓度1∶20 000)，室温下孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL化学发光试剂显色。以GAPDH蛋白条带作为内参。

5.电镜观察胆囊和肝内胆管超微结构：取肝内胆管和胆囊组织，2.0%多聚甲醛和2.0%戊二醛溶液前固定24 h，磷酸缓冲液冲洗，置于1%锇酸中后固定2 h，双蒸水冲洗后系列乙醇脱水，包埋，切片，厚60～90 nm，醋酸铀-柠檬酸铅复染，透射电镜(JEM-1230)下观察并拍照。

三、统计学分析

结 果

一、Claudin蛋白家族在肝脏和胆囊组织中存在特异性高表达

Claudin-1、-2、-3在Cldn-2+/+小鼠肝内胆管和胆囊上皮的表达均较高，而敲除claudin-2基因后，claudin-2表达显著降低，但claudin-1、-3表达无明显差异(图1)。说明claudin蛋白家族在Cldn-2+/+小鼠肝脏和胆囊组织中特异性高表达，Cldn-2-/-小鼠能在肝脏和胆囊组织中实现claudin-2蛋白的特异性敲除，同时不影响其他claudin蛋白的表达。

二、Claudin-2蛋白对肝脏和胆囊组织结构的影响

HE染色示，两组小鼠肝脏和胆囊组织并未呈明显的差异(图2A、2B)。扫描电镜结果显示，与Cldn-2+/+小鼠相比，Cldn-2-/-小鼠静脉区胆管宽度[0.79±0.03)mm对(0.78±0.04)mm]、门静脉区[(0.92±0.03)mm对(0.90±0.02)mm]均无明显差异(P>0.05；图2C)。说明敲除claudin-2基因在组织学上并不会对肝脏和胆囊组织结构产生明显影响。

A：免疫荧光染色；B：蛋白质印迹法

A：肝脏HE染色(×100)；B：胆囊HE染色(×100)；C：扫描电镜(×200)

图2 敲除claudin-2基因对小鼠肝脏和胆囊结构的影响

三、Claudin-2蛋白对胆汁流速的影响

与Cldn-2+/+小鼠相比，Cldn-2-/-小鼠肝内和胆囊胆汁的颜色加深，质地浓稠(图3A)；胆汁流速明显降低[(3.00±0.40)μL·min-1·100 g-1对(5.80±0.32)μL·min-1·100 g-1，P<0.05；图3B]。证实敲除claudin-2基因会导致胆汁分泌的流速降低、胆汁浓缩。

四、Claudin-2蛋白对胆汁成分的调控

与Cldn-2+/+小鼠相比，Cldn-2-/-小鼠肝脏和胆囊胆汁中总胆固醇、磷脂、总胆汁酸、总胆红素含量均明显升高(P<0.05；图3C、3D、表1)。

讨 论

胆囊胆固醇结石的形成机制相当复杂，受到多种因素的影响和调控。研究发现，成核因子和抑成核因子共同参与了胆囊胆固醇结石的形成，其中包括蛋白质、有机离子和无机离子[6-7]。本研究通过Cldn-2-/-小鼠的在体和离体实验证实claudin-2蛋白缺失会改变分泌胆汁成分，进而诱导胆囊结石的形成，有望为寻找遏制胆固醇结石形成的关键因子提供重要突破口。

研究认为，生物系统内外环境的稳定性可通过细胞旁渗透进行调节，细胞旁渗透的破坏可诱发多种疾病。紧密连接作为细胞间的一种连接方式，是细胞旁渗透发挥生理作用的结构基础，可实现水分子和脂溶性物质的选择性转运，为维持上皮细胞内外两个不同环境的稳定提供渗透屏障，进而保证上皮细胞的极性[8]。多种紧密连接蛋白共同组成了细胞的紧密连接，包括claudin蛋白、连接黏附分子(JAMs)、咬合蛋白(occludin)，其中claudin蛋白是紧密连接最重要的组成部分[9-10]。Claudin蛋白家族是一个四跨跨膜蛋白的大家族，目前发现了至少27个成员，在不同细胞系统中发挥不同功能[11]。Claudin-2是claudin蛋白家族中最早发现和研究最多的紧密连接蛋白，能形成阳离子选择性通道[12]。在肾脏组织中，claudin-2基因的缺失会导致小鼠近端小管丧失阳离子选择性，钠离子和氯离子的重吸收受阻[13]。研究发现claudin-2通过形成细胞旁水通道，介导水分子在MDCK细胞间的跨细胞运输[14]。胆管系统分泌的胆汁成分中98%是水，因此胆汁中水分含量会直接影响胆汁流速和成分[1]。本研究发现，敲除claudin-2基因后胆汁中的钠离子浓度降低，胆汁酸和脂质成分浓缩，提示胆管系统中claudin-2缺失可减弱细胞紧密连接中的水分子旁分泌，进而造成胆汁中胆汁酸、胆固醇、磷脂、胆红素等成分的浓缩和相对含量增加，胆汁流速降低，从而促进小鼠胆固醇结石的形成。

*P<0.05

A：肝内胆汁和胆囊胆汁肉眼图；B：胆汁流速；C：肝脏胆汁成分；D：胆囊胆汁成分

图3 Claudin-2蛋白对胆汁流速和成分的调控作用

表1 Cldn-2+/+和Cldn-2-/-小鼠胆汁成分比较

总之，本研究证实胆汁成分和分泌量部分受claudin-2蛋白介导的细胞旁通透性所调节，有望为预防胆石病提供新的治疗靶点，靶向claudin-2调控的细胞旁通透性可能成为治疗各种病因引起的胆汁淤积症的潜在策略。