急性胰腺炎患者血清HMGB1、TLR4、TLR9、DAO水平变化及意义

严苹，柏超，周翔宇，陈霞

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

急性胰腺炎(AP)发病后，释放各种炎症介质，使肠黏膜通透性增强，导致肠黏膜屏障功能损伤，引发肠源性内毒素血症，诱发或加重胰腺的改变，发生“二次打击”，进一步导致多器官功能衰竭及严重感染。高迁移率族蛋白1(HMGB1)作为一种重要的晚期炎症介质，近年来其在AP中的作用日益受到关注及重视，但在临床AP患者肠黏膜屏障损伤中的作用尚需进一步探讨。本研究观察AP患者血清中HMGB1、TOLL样受体(TLR)4、TLR9、二胺氧化酶(DAO)等的水平变化，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年4月～2016年4月就诊于本院消化内科的AP患者59例，均发病<24 h，男38例、女22例，年龄22～66岁；依照《中国急性胰腺炎诊治指南》(2013)[1]和AP亚特兰大分类标准修订(2012)[2]将患者分为轻型AP(MAP)组26例、中度重症AP(MSAP)组17例、重症AP(SAP)组16例。排除标准：发病超过24 h，患有肝炎、疱疹等病毒感染性疾病；系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病；恶性肿瘤；有糖尿病史；其他与AP无关的严重器质性病变。选择同期于本院体检健康的志愿者20例为对照组，男13例、女7例，年龄28～61岁。各组性别、年龄具有可比性。

1.2 血清HMGB1、TLR4、TLR9、IL-6、TNF-α、DAO检测 患者于入院24、48、72 h及对照组于体检24、48、72 h，使用促凝管分别抽取两组静脉血3 mL，均在室温下静置1～2 h，于4 ℃下3 000 r/min离心15 min。将所取得的血清置于-80 ℃冰箱冻存。使用ELISA试剂盒(武汉贝茵莱公司)检测血清HMGB1、TLR4、TLR9、IL-6、TNF-α、DAO，按说明书进行操作。

2 结果

2.1 各组不同时间点血清HMGB1水平比较 详见表1。

表1 各组不同时间点血清HMGB1水平比较

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05；与MAP组同时间点比较，#P<0.05；与MSAP组同时间点比较，△P<0.05；与同组入院48 h比较，★P>0.05。

2.2 各组不同时间点血清TLR4水平比较 详见表2。

表2 各组不同时间点血清TLR4水平比较

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05；与MAP组同时间点比较，#P<0.05；与MSAP组同时间点比较，△P<0.05；与同组入院48 h比较，★P>0.05。

2.3 各组不同时间点血清TLR9水平比较 详见表3。

表3 各组不同时间点血清TLR9水平比较

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05；与MAP组同时间点比较，#P<0.05；与MSAP组同时间点比较，△P<0.05；与同组入院48 h比较，★P>0.05。

2.4 各组不同时间点血清IL-6水平比较 详见表4。

表4 各组不同时间点血清IL-6水平比较

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05；与MAP组同时间点比较，#P<0.05；与MSAP组同时间点比较，△P<0.05。

2.5 各组不同时间点血清TNF-α水平比较 详见表5。

表5 各组不同时间点血清TNF-α水平比较

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05；与MAP组同时间点比较，#P<0.05；与MSAP组同时间点比较，△P<0.05。

2.6 各组不同时间点血清DAO水平比较 详见表6。

表6 各组不同时间点血清DAO水平比较

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05；与MAP组同时间点比较，#P<0.05；与MSAP组同时间点比较，△P<0.05；与同组入院48 h比较，★P>0.05。

2.7 AP患者血清HMGB1水平与DAO的相关性 AP患者血清HMGB1水平与DAO呈正相关(r=0.908，P<0.05)。

3 讨论

AP早期肠道作为全身炎症反应的一个重要靶器官，肠黏膜屏障损害所致的肠道细菌或毒素移位是SAP细菌入侵的主要途径。AP尤其是SAP，释放大量的炎症介质和细胞因子不仅引发全身炎症反应综合征和多器官功能障碍，还可进一步损伤肠黏膜屏障功能。本研究结果显示，AP患者炎症因子TNF-α、IL-6水平升高，SAP患者升高更明显，但在起病24 h后逐渐下降，可见炎症因子水平变化可反映疾病的严重程度。

HMGB1是一种广泛存在于哺乳动物细胞核内的非组蛋白，是迄今为止发现的惟一能在胞外诱导细胞因子分泌和活化炎症细胞DNA结合的蛋白，核内HMGB1可通过炎症细胞的主动分泌和坏死细胞的被动释放转移至胞外，是重要的炎症介质[3]。近年来Meta分析结果表明AP患者血清中HMGB1水平升高，HMGB1可作为AP的生物学指标之一[4]。现有研究显示，AP小鼠小肠黏膜组织中HMGB1水平升高，说明HMGB1参与了AP时肠黏膜损伤。DAO是一种含有脱胺的腐胺和组胺的细胞内酶，存在于人和哺乳动物的小肠黏膜和纤毛上皮细胞中，以空、回肠活性最高，正常人血清中含量很低；肠黏膜细胞受损、坏死后该酶释放入血，导致血清DAO活性增高，测定血中DAO的活性可反映肠黏膜损伤和修复的情况[5]。本研究采用DAO作为评估肠黏膜屏障的血清学指标，发现AP患者存在肠黏膜损伤，SAP患者损伤更明显。本研究发现， AP患者血清HMGB1水平均较对照组高，起病48 h达峰值，MSAP及SAP患者血清HMGB1水平在起病72 h仍维持在较高水平。进一步相关分析发现AP患者血清中HMGB1水平与DAO呈正相关，提示HMGB1可能参与了AP患者肠黏膜屏障损伤的发生发展。

HMGB-1属于损伤相关性模式分子(DAMPs)中的一种重要分子。DAMPs可以激活Toll样受体、NOD样受体等模式识别受体。其中Toll样受体被认为是启动炎症反应的“门户”蛋白。TLR4可与巨噬细胞、中性粒细胞分泌的HMGB1结合，招募髓系分化蛋白88和IL-1受体相关激酶，再与下游调节因子TRAF结合，进而激活MAPK途径和核转录因子的核转录，诱导炎症反应的发生[6]。近年来有报道[7]指出HMGB1-DNA复合体可激活TLR9信号通路，通过激活NF-κB或JAK/STAT通路高度活化，促进免疫细胞进一步成熟和分泌细胞因子(IL-1β、TNF-α)等。有研究表明，TLR4在SAP初期参与了机体炎症反应，并导致SAP恶化[8]，而TLR9拮抗剂预处理的AP小鼠其胰腺坏死和肺的炎症均有不同程度的减轻，TLR4、TLR9通过各自相应的信号通路可使NF-κB活化，促使TNF-α、IL-1、IL-6等表达增加[9，10]，造成肠道自身免疫损伤。因此，本研究同时检测了HMGB1的下游受体TLR4、TLR9，结果显示，AP各组血清TLR4、TLR9水平较对照组升高，且在起病48 h达峰值，但MSAP及SAP患者在起病72 h仍维持较高水平。因此，HMGB1有可能通过激活下游受体TLR4、TLR9参与了AP时的肠黏膜屏障损伤。