黏附分子在EMT及癌细胞干性调节中的分子机制研究进展

周德望，杨勇

(中国药科大学药物科学研究院，江苏 南京 211198)

对于多细胞生物而言，细胞-细胞黏附是基本的生物学过程，它影响着细胞和组织的形态[1]。细胞间黏附及细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的信号传导与其他相关基因紧密协调以维持组织稳态[2-3]。在转移性癌症发展过程中细胞-细胞黏附会被破坏，随后黏附介导的信号会增强细胞能动性。上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)常发生在肿瘤进展和胚胎发育的过程中，其导致细胞间强黏附且具有上皮形态的细胞转化为更具能动性和侵袭性的细胞，如间质细胞[4]。EMT会引发基于钙粘蛋白(cadherin)的同型细胞间强力连接的弱化及减弱细胞借助钙粘蛋白-连环蛋白(catenin)锚定至细胞骨架的能力，进而诱导黏附能力较弱或异型黏附的黏附分子表达。这些特性促使癌细胞从原发组织脱离，减弱癌细胞与ECM组分和其他细胞(例如成纤维细胞)结合的能力，从而向淋巴和血液系统迁移。此外，转移性肿瘤细胞还具备正常干细胞的特性，这种癌细胞常被称为癌症干细胞(cancer stem cells,CSCs)[5]。

细胞-细胞黏附受细胞黏附分子(cell adhesion molecules,CAMs)调节，细胞黏附分子是与细胞骨架连接的跨膜受体，其控制细胞组装成三维结构如组织[6]。CAMs影响着细胞与周围环境的相互作用并调节其对外部刺激的反应，并且CAMs的表达及其相关信号的传导在癌症发展的不同阶段中均起重要作用[6]。本文综述了细胞黏附分子及其分子机制调控不完全EMT状态及癌细胞干性的分子机制。

1 黏附分子与不完全的EMT

癌细胞可经EMT增强细胞的能动性和侵袭性进而增强其转移能力，而且EMT还具有诱导细胞干性的能力[7-8]。有研究表明转移性癌细胞的存活依赖于上皮细胞角蛋白(cytokeratin，CK)的表达，成功转移还需要上皮细胞黏附蛋白(E-和P-cadherin)和细胞角蛋白(CK5、CK8和CK14)的表达[9-10]。这些研究说明识别逐步EMT阶段的CAMs在肿瘤转移的过程中扮演着重要的角色。虽然在EMT期间细胞的黏附性质会发生改变，但在正常胚胎发育期间或癌症期间很少见到从上皮状态到间质状态的二元转换[11]，在皮肤癌和乳腺癌小鼠模型和患者来源的异种移植物(patient-derived xenograft ,PDX)模型的研究中，根据上皮标记物上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)的丧失和细胞- ECM黏附受体整合素α5(CD51)，整合素β3(CD61)和血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM1)(CD106)获得的程度，将经历EMT的癌细胞细分为6种表型和功能上不同的状态[12]。此外，被动转移模型表明不完全的EMT亚型的细胞更容易进入循环，定植在肺并形成转移[12]。

在肿瘤细胞中观察到的这种不完全的EMT可以解释肿瘤细胞的异质性及肿瘤生态位中各种癌细胞具有不同致瘤能力。具有不完全EMT的癌细胞被认为在肿瘤出芽，侵袭和定植中更有效，因为这些过程显然EMT和间质-上皮转换(mesenchymal-to-epithelial transition,MET)[10]。但具有不完全EMT特性的癌细胞在EMT与MET间的转换的分子机制仍缺乏清晰的认识。

2 不完全的EMT，循环肿瘤微栓子和转移

近年来的研究表明，癌细胞的扩散主要以多细胞簇而非单细胞的形式发生。在肿瘤转移能力中起关键作用的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)也有着不完全EMT的状态。由于单个肿瘤细胞表面上存在EpCAM，细胞彼此保持着黏性，CTCs得以形成循环肿瘤细胞簇或称为循环肿瘤微栓子(circulating tumor microemboli,CTM)[13-14]。在不同类型的癌症(乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌和前列腺癌)研究中均发现了CTM的存在，并且在转移的后期观察到CTM数量的增加[15-16]。CTM中的单个细胞有着不同的EMT亚型，这样的状态有助于其在循环，外渗以及肿瘤细胞定植过程中存活[12,14,17-18]。以往的研究认为单个播散性肿瘤细胞是转移性肿瘤的前体。当涉及一簇不同的肿瘤细胞时，便会形成多克隆的转移组织[13]。CTM的发现进一步佐证了以往的研究，且为癌症治疗的个体差异性及耐药性提供了可能的解释。

在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)中，E-cadherin+,claudin-7+，EpCAM+的不完全EMT细胞主要以CTM的形式参与转移[17]。在一项人乳腺癌的研究中发现CTM比CTCs更具转移性,而且CTM中γ-catenin表达会增加[19]。γ-catenin是β-catenin的旁系同源物，除了与黏附连接的相互作用外，还是桥粒的关键组分，桥粒是一种特殊的上皮细胞-细胞黏附结构。β-catenin过表达会促进肿瘤发生，而γ-catenin主要与肿瘤抑制相关[20]。有趣的是，表达γ-catenin的乳腺癌细胞易脱落成为更具转移性的CTM进入循环系统，而缺乏γ-catenin细胞偏向以单细胞的形式参与转移的过程。因此有人推测表达γ-catenin的CTM比单个肿瘤细胞更易被困在小毛细血管中，从而促进CTM外渗到远端器官[19]。

3 上皮-间质转化，癌症干细胞和转移

基于肿瘤组织连续切片发现癌细胞中细胞黏附和细胞干性之间存在着一定的联系，研究发现肿瘤边缘的细胞(最终萌芽进入循环和转移)可检测到明显的EMT和干细胞的标志物[23]。在结直肠癌和胰腺癌中发现肿瘤起始干细胞上皮-间质转化的转录因子(EMT transcription factor,EMT-TF)ZEB1(其抑制E- cadherin转录)和SNAIL的表达增加。SNAIL(另一种EMT-TF)表达可稳定β-catenin进而促进结肠直肠癌(colorectal cancer,CRC)中干细胞生态位的扩增[24]。这些结果表明EMT可诱导侵袭性癌细胞的干性。由于E-cadherin的丧失和上皮细胞转变为间质状态通常被认为是转移性肿瘤干细胞的特征，因此药理学触发的MET也许是消除肿瘤起始细胞的有效的治疗方法[25]。实际上，通过在乳腺肿瘤干细胞中诱导MET和E-cadherin表达(通过环腺嘌呤核糖核苷酸(cyclic AMP,cAMP)的增加及其激活的蛋白激酶A(protein kinase A,PKA))可观察到致瘤能力的抑制[26]。

然而，MET的诱导可能并不总是阻断转移的有效手段，因为一些研究报道成功转移通常需要EMT的部分丧失或MET[27-29]。例如，乳腺癌细胞中EMT-TF Prrx1的缺失会诱导MET进而导致CSC生态位的建立，而且MET是转移所必需的[27]。在鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)中，Twist-1介导的EMT是发性肿瘤细胞的局部侵袭和肿瘤细胞进入循环所必需的，但是Twist-1的沉默和E-cadherin的重新获得对于远处组织中的外渗和定植是必要的[28]。 TGF-β通过活化分化-1的抑制剂(inhibitor of differentiation-1,ID1)触发MET，导致E-cadherin的再表达并与β-catenin螯合，以及vimentin的丧失[29]。ID1诱导的MET同样赋予肿瘤细胞类似CSCs的特征(CD44high/ CD24low细胞的富集和乳腺球的形成)。虽然在原发肿瘤部位EMT和E-cadherin 的缺失都会促进肿瘤的转移，但转移灶中的CSCs在TGF-β和ID1的影响下会重新表达E-cadherin 。这些研究结果表明，癌细胞的上皮或间质状态影响其干性/侵袭性取决于细胞是定位于原发性肿瘤，循环还是位于远端转移部位。在另一项乳腺上皮细胞的研究中，Twist-1的长期持续性的活化会导致非增殖性迁移细胞的产生，而瞬时诱导Twist-1导致E-cadherin，波形蛋白与干性相关的蛋白一同表达，并增强肿瘤细胞的侵袭能力[30]。皮肤癌细胞中的Twist-1水平决定了它们的侵袭程度，但低Twist-1(低E-cadherin，良性乳头状瘤)和高Twist-1(无E-cadherin，恶性肿瘤)细胞均显示干细胞样行为，表明癌细胞的干性不需要完全丧失上皮表型[31]。最后，许多最近的研究还指出同时具备上皮和间质特性的细胞如何富含CSCs标志物，变得更具转移性，以及这些细胞在失去E-cadherin之前如何获得干细胞样特征[12,17-18，29]。

上皮细胞或间质细胞黏附特性也可参与确定肿瘤细胞的转移部位(器官性)。 在PDAC的小鼠模型中，黏附连接斑块蛋白δ-catenin(p120)稳定E-cadherin对于肝转移是必需的，而完全EMT的细胞会转移至肺，即使在没有p120的情况下也是如此[30]。因此，虽然原发肿瘤部位的EMT会增强肿瘤细胞的侵袭性且与干性相关，但仍对成功转移是否需要部分恢复上皮状态和获得CSCs的特性缺乏清晰的认识。

4 黏附分子调控癌细胞干性的信号通路

参与E-cadherin缺失的EMT-TF的相关研究表明，细胞黏附特性的改变是建立和维持癌细胞干状所必需的[25]。在正常干细胞和CSCs中，WNT信号的激活和细胞黏附中EMT相关的变化涉及β-catenin从黏附连接处被置换，从而将E-cadherin与肌动蛋白细胞骨架连接[32]。在大多数类型的癌症中，β-catenin积累并逃避蛋白酶体破坏其复合物，进而易位到细胞核中与T细胞因子(T-cell factor,TCF)一同诱导靶基因的反式激活，这些靶基因包括促进CSCs产生的CAMs[32-33]。β-catenin-TCF靶基因CD44被EMT诱导，然后整合多种信号通路诱导肿瘤细胞的干性。 CD44还会与透明质酸结合将细胞锚定至ECM激活各种细胞信号通路诱导肿瘤细胞的干性[34]。此外，研究发现核β-catenin的累积增加正常肠上皮细胞和CRC细胞中的CD44表达。CD44会磷酸化WNT受体LRP6增强WNT/β-catenin信号，并通过各种CSCs亚群中的JAK / STAT3途径促进肿瘤的进展。在鼻咽癌和乳腺癌中，CD44激活STAT3并促进干细胞样亚群的维持并促进肿瘤的进展。除WNT /β-catenin和JAK / STAT3信号传导外[35-36]。CD44还诱导PI3K / AKT信号传导。目前CD44s和CD44v已被确认为几种癌症的预后标志物，且有抗CD44抗体和CD44拮抗肽用于靶向癌症治疗[37]。

神经细胞黏附免疫球蛋白样分子L1是另一种WNT /β- catenin靶基因，它通过激活各种信号通路诱导癌细胞的干性[35]。β-catenin-TCF的激活会促进CRC细胞L1的表达，导致细胞能动性及侵袭性增强诱发肝转移[38-39]。L1通过支架蛋白ezrin和Rho相关蛋白激酶激活B细胞核因子κ轻链增强子(nuclear factor kappa light chain enhancer of B cells,NF-κB)信号，导致肠和结肠上皮干细胞标志物IGFBP2、SMOC2和LGR5的转录升高[40]。L1介导的NF-κB信号传导诱导和干细胞相关基因的激活表明NF-κB活化可诱导去分化和肠上皮细胞中CSCs的建立。在CRC细胞中，L1介导的β-catenin-TCF反式激活导致ASCL2增加，ASCL2通过调节各种干性相关基因来确定肠干细胞的命运。目前针对L1的治疗方法已在几种不同的癌症中展现疗效，治疗方法包括短发夹RNA/小干扰RNA(shRNA/siRNA)介导L1下调或针对L1的高亲和力单克隆抗体[41]。

5 结论与展望

在原发性肿瘤形成后，远端转移的发展涉及许多阶段，甚至需要数十年的时间。转移过程涉及的众多步骤的分子机制仍知之甚少。虽然EMT被认为是肿瘤转移的关键步骤，但最近的体内研究表明，EMT不会通过从上皮细胞到间质状态的二元步骤进行的，而是涉及许多阶段和不同的上皮/间质状态的变化。上皮/间质状态，干性特征的发展，以及在长期转移过程中一些性状的获得或丧失表明癌细胞的高度可塑性。

在同一肿瘤中存在许多有着不同程度EMT的肿瘤细胞亚群，但哪个EMT阶段对于诱导干细胞性状是必需的，并且该过程中涉及的分子信号通路仍有待确定，这些不同肿瘤细胞亚群对于成功转移的作用和必要性也有待进一步研究。虽然参与转分化和不完全EMT表型的CAMs及相关细胞骨架蛋白的研究才刚刚起步，但建立合适的动物模型，合理利用临床样本，或许有望能确定细胞黏附与这些癌细胞表型变化,相关的干性性状及其与转移的发展相关的分子特性,以期为癌症治疗提供有效的途径。