牛磺熊去氧胆酸预防高脂饮食小鼠胆囊结石的研究

陆启帆， 蒋兆彦， 王启晗， 赵 刚， 胡 海

（同济大学附属东方医院胆石病中心，上海 200120）

胆石病是全世界常见的消化系统疾病之一,近年来发病率逐年上升。胆结石按种类可分为胆固醇结石、胆色素结石及混合性结石。超过90%的胆结石由胆固醇组成,并在胆囊内形成。有研究表明高脂饮食可影响小鼠的肠道菌群结构，而肠道菌群结构的改变则会影响小鼠血清及肝脏的脂质含量［1］。牛磺熊去氧胆酸 (tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)作为一种胆石病治疗药物，可有效降低胆囊胆汁的胆固醇含量，降低胆囊结石的成石率［2］，并增加胆囊胆汁中的胆汁酸含量，防止胆囊胆固醇结石的形成。关于TUDCA降低胆囊结石成石率，多数文献指出，是增加胆汁酸量，改变肝脏胆固醇代谢所致。本研究通过体视镜观察，肠道菌群结构分析及定量实时聚合酶联反应 (quantitative real time polymerase chain reaction，q-PCR)等方法，检测小鼠的胆囊结石形成情况，肠道菌群结构变化,及肝脏、肠道中脂质和胆汁酸代谢相关基因的变化，以探讨TUDCA通过改变高脂饮食小鼠肠道菌群结构达到降低成石率的目的。

材料与方法

一、材料

健康雄性SPF级c57bl/6小鼠30只，4周龄，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供。ABI Q6 Flex荧光q-PCR系统，Trizol总RNA提取试剂购自ThermoFisher Scientific(批号176407)，逆转录试剂盒购自ThermoFisher Scientific(批号00634069)，胆固醇检测试剂盒购Roche Diagnostics GmbH(批号31851101)，三酰甘油检测试剂盒购自Roche Diagnostics GmbH(批号34174001)，磷脂检测试剂盒购自Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation(批号AQQ6933)，胆汁酸检测试剂盒购自Randox Laboratories Ltd(批号 416850)。

二、方法

(一)动物模型制备

小鼠普通饲料喂养1周后，随机分为两组：给予成石饲料(lithogenic diet，LD)(普通饲料98.25%+1.25%胆固醇+0.5%胆盐)，为LD组(15只)；给予预先配比混有TUDCA的饲料 (TUDCA 5 g/kg LD)，为TUDCA组(15只)。每只笼内饲养5只。动物均在实验室标准条件下生长(光照和黑暗各12 h，21℃～24℃，湿度 50%～55%)。每天每笼给予20 g饲料，喂养8周。

(二)组织样本采集

喂养8周后，使用4%水合氯醛麻醉。摘取眼球取血，颈椎脱臼处死小鼠，固定于取样台。取胆囊、肝脏、小肠，放入冻存管液氮冻存，-80℃冰箱保存。

(三)总 RNA提取

取50 mg肝脏及小肠组织置于冻存管中，加入500μL Trizol液，彻底匀浆后转移至新的离心管中，加入500μL Trizol液及200μL氯仿，剧烈震荡混匀后4℃离心，12 000转/min，5 min，将离心后的上层水相转入新离心管中，加入500μL异丙醇并混匀后，4℃离心，12 000转/min，10 min，弃去上清液，用无水乙醇及DEPC水配成的75%乙醇1 mL洗涤沉淀，用DEPC水溶解沉淀并调整浓度至200 mg/L即为用于逆转录的总RNA。

(四)q-PCR检测

应用q-PCR法，以GAPDH为内参，检测两组小鼠肝脏 Abcg5、Abcg8、Abcb11、Acat2、Cyp27、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factorα,TNF-α)及小肠 Hmgcr、Npc1L1、Fgf15(中英文全称见后)mRNA表达水平。将提取得到的总RNA取2μg按照Thermo Fisher逆转录试剂盒说明书进行逆转录得到cDNA。所有检测基因的引物序列见表1。

(五)肠道菌群结构分析

收集第8周小鼠的粪便共计30份，提取其中微生物总DNA。针对16 SrDNA基因V4区合成特有引物，行PCR扩增并完成文库构建。在MiSeq平台进行测序与分析。

(六)肝脏脂质提取和测定

取50 mg小鼠肝脏，切碎后置于试管。每管加入3 mL Folch液(三氯甲烷∶甲醇=2∶1)4℃过夜。然后转移至新试管，另加1 mL Folch液淋洗。将1 mL淋洗液再加入。按照检测种类不同，吸取不同量液体(总胆固醇100μL，三酰甘油50μL)至新试管中，57℃恒温干燥。按照胆固醇及三酰甘油检测试剂盒说明书测定。

(七)胆汁酸检测

取胆囊胆汁，滴入干净的离心管中。胆汁经甲醇稀释后，分别使用胆汁酸检测试剂盒以及磷脂检测试剂盒进行测定。胆囊胆汁胆固醇饱和指数则通过Carey表计算得出。

三、统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行分析。所有数据以均数±标准差表示，采用t检验。检验水准α=0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、成石率及肝脏病理改变结果

在体视镜下观察可知，LD组小鼠胆囊中均可见圆润成型的胆固醇结石同时伴有大量的胆固醇结晶(见图 1A、B)，成石率 100%。TUDCA组小鼠胆囊则呈现为清澈透亮状(见图2A、B)，并未发现有成型的胆固醇结石，仅在其中3只小鼠胆囊内发现少量散在结晶(见表2)。HE染色的小鼠肝脏病理切片，发现LD组肝脏出现严重的脂肪变形(见图3)，而TUDCA组肝脏细胞形态良好(见图4)。

表2 小鼠胆囊大体情况

二、肝脏与血清脂质检测结果

为进一步分析TUDCA对于胆固醇代谢的影响，实验检测了两组小鼠肝脏以及血清的脂质含量(见图5A、表3)。结果发现与LD组相比，TUDCA组小鼠血清的总胆固醇、高密度脂蛋白(high-density lipoproteins,HDL)胆固醇及低密度脂蛋白(lowdensity lipoproteins,LDL)胆固醇含量均显著下降(P＜0.01)。同时两组小鼠肝脏的脂质含量检测发现，与LD组相比，TUDCA组肝脏的三酰甘油及胆固醇含量显著下降(P＜0.01)(见图5B、表4)。

图1 LD喂养小鼠8周后的肝脏及胆囊

图2 LD+TUDCA喂养小鼠8周后的肝脏及胆囊

表3 血清脂质含量检测（mmol/L）

表4 肝脏脂质检测（mg/g）

表1 相关指标引物序列

图3 LD喂养小鼠8周后的肝脏病理切片（HE，×20）

图4 LD+TUDCA喂养小鼠8周后的肝脏病理切片（HE，×20）

三、TUDCA治疗后小鼠肠道菌群的变化

图5 肝脏及血清脂质检测结果

对小鼠盲肠内容物的菌群测序显示，TUDCA组肠道厚壁菌门丰度较LD组增加，而拟杆菌门丰度则降低(见图6A、B、C)，厚壁菌门/拟杆菌门比值上升3.13倍(见图6D)，两组肠道菌群比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)(见表5)。

表5 肠道菌群

四、小肠脂质及胆汁酸代谢相关基因检测结果

与小肠胆固醇转运蛋白有关的关键蛋白Npc1L1(Niemann piok typec1 like1)、ATP 结合盒 G5(ATPbinding cassette,Abcg5)和G8(ATP binding cassette,Abcg8)基因的mRNA表达量在两组间差异均无统计学意义 (P＞0.05)。但与LD组比较，TUDCA组的小肠中3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶 (3-hydroxy-3-methylglutaryl-Co A reductase,Hmgcr)的表达下降(P＜0.05)(见表 6、图7A)。 此外，成纤维细胞生长因子15(fibroblast growth factor 15,Fgf15)表达在TUDCA组显著上升(P＜0.001)(见表6、图 7B)。

五、肝脏脂质及胆汁酸代谢相关基因检测结果

与LD组比较，TUDCA组肝脏Abcg5及Abcg8基因表达量均有所下降，同时TUDCA组肝脏的胆汁酸转运基因Abcb11(ATP binding cassette subfamily B member 11)表达量则显著上升。实验还发现，TUDCA组肝脏的乙酰辅酶A乙酰基转移酶2(acetyl-coenzyme A acetyltransferase 2,Acat2)表达量也有所上升。与LD组相比，TUDCA组肝脏的胆汁酸合成限速酶Cyp27(sterol 27-hydroxylase)的表达量也明显上升。两组比较其差异均有统计学意义(P＜0.05)(见图 8A、表 7)。与 LD 组比较，TUDCA 组肝脏TNF-α表达量显著下降(见图8B)。

表6 小肠组织q-PCR检测结果

六、两组小鼠胆囊胆汁成分测定

实验检测两组小鼠的胆囊胆汁成分发现(见图9)。与LD组相比，TUDCA组小鼠胆囊胆汁内的胆固醇、磷脂、总脂质含量及胆固醇饱和指数均明显下降，同时胆囊胆汁内的胆汁酸含量则明显上升。两组比较差异均有统计学意义(见表8)。

讨 论

一、TUDCA降低胆囊结石的发生率

图8 小鼠肝脏胆固醇及胆汁酸代谢相关基因检测

图9 小鼠胆囊胆汁成分测定

表8 胆囊胆汁成分检测结果

胆囊胆固醇结石的形成与胆囊胆汁胆固醇过饱和导致的胆固醇析出形成胆固醇结晶有关［3］。本研究发现，TUDCA可显著预防小鼠胆囊胆固醇结石的形成，仅3只小鼠见胆囊胆汁内胆固醇结晶。这与使用TUDCA后降低胆囊胆汁胆固醇饱和指数有关。在临床上，TUDCA治疗也具有明显降低体内胆固醇含量的作用［4］。本研究结果显示，TUDCA治疗后小鼠血清及肝脏胆固醇含量均显著降低，且肝脏脂肪浸润明显改善，表明TUDCA具有降低高胆固醇饲料喂养小鼠整体的胆固醇含量效应。

二、TUDCA影响体内胆固醇代谢

胆汁酸是胆汁的主要成分之一，是具备亲水性和疏水性的两性分子，按照特性不同可分为亲水性胆汁酸及疏水性胆汁酸。亲水性胆汁酸可稳定肝细胞膜，拮抗疏水性胆汁酸的细胞毒性作用。TUDCA作为亲水性胆汁酸的代表，具有降低小肠胆固醇吸收的效应［5］，进而减少机体对饮食胆固醇的摄取，降低胆固醇负荷。 此外，Mueller等［6］研究发现短期使用UDCA尚可促进胆汁酸合成和胆固醇转化。本研究显示，胆汁酸合成关键酶Cyp27表达上升，可能反映TUDCA治疗后对胆汁酸合成的促进效应。Abcg5和Abcg8是肝脏胆小管侧膜分泌胆汁胆固醇的关键转运蛋白。笔者发现TUDCA治疗后显著降低Abcg5和Abcg8在小鼠肝脏的表达，因而对于降低肝细胞向胆汁分泌胆固醇，降低胆汁胆固醇饱和指数有重要作用，与TUDCA组胆结石形成的减少密切相关。

三、TUDCA通过改变肠道菌群丰度与分布降低成石率

小肠作为吸收和合成胆固醇的场所之一，高胆固醇饮食将会影响肠道菌群的丰度与分布，进而导致肠道对于脂质的吸收增加及全身肥胖［7］。有文献指出胆结石病人肠道菌群结构与正常人显著不同，改变肠道菌群结构会增加胆囊结石患病的易感性［8-9］。改善肠道菌群结构则有助于肝脏胆固醇转化为胆汁酸及抑制血清及肝脏内胆固醇积聚，并进一步降低胆囊胆汁胆固醇含量。Hildebrandt等［10］研究发现，给予小鼠高脂饲料即高胆固醇、无胆酸饲料喂养时，小鼠肠道内变形菌门数量上升。笔者团队既往研究发现，给予小鼠成石饲料即含有高胆固醇、低浓度胆酸饲料喂养时，与普通饲料相比，小鼠肠道内厚壁菌门/拟杆菌门比值下降、胆囊结石形成［11］。Islam等［12］通过给予大鼠含高浓度胆酸(2 g胆酸/kg饲料)的饲料10 d后发现，小鼠肠道内厚壁菌门占比增加而拟杆菌门占比减少。笔者给予小鼠饲料(5 gTUDCA/kg LD)后，小鼠肠道菌群结构中厚壁菌门丰度占比上升，而拟杆菌门丰度占比下降，TUDCA组厚壁菌门/拟杆菌门比是成石组的3.13倍。笔者认为造成高脂饲料、高脂+低浓度胆汁酸饲料及高脂+高浓度胆汁酸饲料之间肠道菌群结构差异的原因可能是，胆汁酸对于肠道细菌具有强烈的选择性，高浓度胆汁酸抑制了肠道中部分不耐受胆汁酸的细菌增殖。Wang等［13］研究发现，经熊去氧胆酸处理后，高脂饲料喂养的大鼠血清及肝脏脂质含量明显下降。本研究发现，TUDCA处理后的小鼠血清及肝脏脂质含量也明显下降，同时，小鼠肠道内的胆固醇转运蛋白Npc1L1、Abcg5、Abcg8基因的 mRNA表达量在两组间差异均无统计学意义。这表明TUDCA减少血清以及肝脏脂质含量的方式并不是通过抑制小肠胆固醇转运。Degirolamo等［14］研究发现，肠道中厚壁菌门数量的上升可通过上调Cyp7及Cyp27的表达来增加肝脏胆汁酸的合成。Jia等［15］研究发现，肠道菌群数量上升产生大量胆汁酸水解酶，在肠道内将结合胆汁酸水解为大量次级胆汁酸：石胆酸(lithocholic acid,LCA)及脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)，而G蛋白胆汁酸偶联受体5则受LCA及DCA的激活抑制肝脏胆汁酸的合成。Juste［16］研究发现，肠道内的胆汁酸水解酶主要由拟杆菌门细菌产生，而本研究发现，经TUDCA处理后，肠道拟杆菌门占比由LD组中的25.70%显著下降至TUDCA组中的10.67%。 Hu等［17］研究发现，LD饲料中高水平胆固醇含量可显著增加肠壁通透性，导致细菌脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)过量入血，从而导致TNF-α表达上升、胆固醇积聚和肝脏损伤。本研究发现，TUDCA组肝脏TNF-α的表达量显著下降，在大体及RNA水平均显示肝脏损伤减轻，表明LPS入血减少。由于高浓度胆汁酸对于肠道菌群强烈的选择性抑制作用，使用TUDCA处理后上调厚壁菌门在肠道菌群中的比例，下调肠道菌群中拟杆菌门的比例，降低肠道菌群的丰度，同时减少菌群分泌LPS的入血，最终增加肝脏胆汁酸的合成、减少小鼠体内血清及肝脏的胆固醇积聚。这与本研究发现的小鼠胆囊胆汁胆汁酸含量上升，血清及肝脏胆固醇含量显著下降的结果一致。机制简图见图10。

综上所述，本研究表明TUDCA预防小鼠胆囊胆固醇结石形成，其机制包括：①通过增加胆汁酸亲水性，抑制小肠胆固醇吸收和肝脏胆固醇负荷，降低肝脏Abcg5和Abcg8表达,以减少分泌胆汁中的胆固醇，进而降低胆固醇饱和指数；②TUDCA因其亲水特性，降低胆汁中胆汁酸的疏水指数，进而增加胆固醇在胆汁中的溶解度；③TUDCA可增加肠道厚壁菌门比例、降低拟杆菌门的比例，可能促进胆汁酸合成，并减少LPS入血造成肝脏炎症。

图10 TUDCA降低胆囊胆固醇结石成石率的机制简图