护卵汤对卵巢储备功能减退大鼠卵巢指数及卵泡数量的影响

邱冉冉，邹芝香，曾 晶，谈珍瑜

（湖南中医药大学第一附属医院妇产科，湖南长沙410007）

卵巢储备功能（OR）指卵巢皮质区卵泡生长、发育并形成可受精的卵母细胞的能力，此能力取决于卵巢内库存卵泡的数量和质量。随着成年女性年龄的增长，卵巢储备功能呈逐渐下降趋势，主要表现为卵泡的数量和质量下降，临床上将其称为卵巢储备功能减退（DOR）。DOR 是一个渐进的过程，若未引起足够的重视，可进一步导致机体内激素分泌紊乱，从而出现月经失调、闭经甚则不孕等妇科病症，并最终发展为卵巢早衰。前期研究已经证实，护卵汤既可改善卵巢早衰患者的血清激素水平和主要症状［1］，又可通过多种途径改善免疫性卵巢早衰动物模型的卵巢功能及免疫功能［2-4］。本研究以环磷酰胺（CTX）所致DOR 动物模型为实验对象，进一步探讨护卵汤对DOR 动物模型卵巢指数及形态的影响，为中医药防治卵巢储备功能减退，预防卵巢早衰的发生提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康SPF 级SD 大鼠60 只，雌性，未孕，体质量180～220 g 左右，由湖南中医药大学动物实验中心提供，合格证号：SCXK（湘）2009-0004。

1.1.2 主要试剂与仪器 环磷酰胺（粉剂，200 mg/支，国药准字H32020857，江苏恒瑞医药股份有限公司）；电子天平（KT-5HL），组织包埋机（YB-6D），组织切片机（LEICARMZO15 1.4.5），组织自动脱水机（ZT-12P），双目显微镜（德国LEICA 公司，LEICADMLB2），Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件（美国，Media Cybernetics），超低温冰箱（三洋公司，MDF-U5411），超净工作台（苏州进化设备有限公司，YJ-450）。

1.1.3 实验药物 护卵汤药物组成及剂量为：菟丝子15 g，石斛10 g，生地10 g，熟地10 g，覆盆子10 g，桑椹子10 g，肉苁蓉10 g，南沙参10 g，山药10 g，莲肉10 g，莲心3 g，月季花5 g，甘草3 g，每剂总质量116 g，由湖南中医药大学第一附属医院提供。补佳乐（有效成分为戊酸雌二醇）购自拜耳医药保健有限公司，国药准字J20171038。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 60 只大鼠适应性喂养7 d 后，行阴道脱落细胞涂片观察其性周期变化，选取动情周期为4～5 d 的雌性大鼠48 只纳入正式实验。然后采用随机数字表法，将其分为空白组、模型组、护卵汤组和补佳乐组4 组，每组12 只。

1.2.2 模型制备 模型组、护卵汤组和补佳乐组3 组大鼠参考相关文献［5-7］，采用环磷酰胺（CTX）单次腹腔注射的方法制备卵巢储备功减退大鼠模型，注射剂量为75 mg/kg，注射容量为1 mL（用生理盐水配制）；同时，空白组大鼠给予生理盐水1 mL单次腹腔注射。

1.2.3 给药方法 将护卵汤饮片加水浸泡0.5 h后，水煎2 次，滤汁弃渣，合并药液，浓缩至含生药1.045 g/mL 的药液；用生理盐水将补佳乐稀释后，制备成含药量为0.009 mg/mL 的药液。

自造模第1 天开始，每天给予护卵汤组大鼠1 mL/100 g 护卵汤浓缩液灌胃；每天给予补佳乐组大鼠1 mL/100 g 补佳乐稀释液灌胃；空白组、模型组大鼠每天按相同剂量给予生理盐水灌胃。每天1 次，连续4 周，每周休息1 d。

1.2.4 检测指标与方法

1.2.4.1 卵巢指数 最后一次给药结束24 h 后处死大鼠，打开腹腔，完整取出双侧卵巢，去掉筋膜及脂肪组织，分别用电子天平称重，计算卵巢指数。

卵巢指数=双侧卵巢湿重（mg）÷大鼠体质量（g）×100%。

1.2.4.2 卵巢组织形态学观察 双侧卵巢称重后，取右侧卵巢置于4%多聚甲醛中固定，然后经充分水洗，70%、80%、95%、100%酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，连续切片（厚度约5 μm），选取第10 张切片，脱蜡，常规HE 染色后，镜下观察，累积计数原始卵泡、初级卵泡、窦状卵泡和闭锁卵泡数目。

1.3 统计学方法

所有数据均采用SPSS 20.0 统计软件进行统计。计量资料用均数±标准差（x±s）表示。两组计量资料中方差齐性的组间比较采用成组t检验，方差不齐的采用秩和检验。多组计量资料两两比较，方差齐性的采用单因素方差分析，方差不齐时，用非参数秩和检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般状况

整个实验过程中，空白组大鼠活动、饮食及二便情况均正常，皮毛整洁，有光泽，体质量渐增，动情周期规律；模型组大鼠腹腔注射CTX 后活动、进食及大便次数均减少，大便偏稀，毛色枯燥且有不同程度脱毛，体质量不增反降，动情周期明显延长且紊乱，镜下可见上皮细胞增多，多处于动情间期；护卵汤及补佳乐组与模型组大鼠相比，上述异常表现均较轻微。

2.2 护卵汤对DOR 大鼠卵巢湿重及卵巢指数的影响

与空白组相比，模型组大鼠左、右两侧卵巢湿重，卵巢指数均降低（P＜0.01）；与模型组相比，护卵汤组和补佳乐组大鼠左、右两侧卵巢湿重，卵巢指数均增高（P＜0.01，P＜0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠卵巢湿重及卵巢指数的比较 （x±s）

2.3 护卵汤对DOR 大鼠卵巢组织形态及卵泡数量的影响

2.3.1 护卵汤对DOR 大鼠卵巢组织形态的影响 肉眼可见空白组大鼠卵巢形态饱满，颜色鲜红，周围细小颗粒较多；其他各组大鼠卵巢形态较小，颜色偏暗，细小颗粒较少，部分卵巢皱缩。镜下观察后发现，空白组大鼠的卵巢结构清晰，可见到始基、窦前、窦状及闭锁卵泡等各级卵泡，卵泡发育良好，且体积比较大；模型组大鼠各级卵泡数目较少，卵泡发育萎缩，体积较小，卵泡内颗粒层数少；护卵汤及补佳乐组大鼠卵巢组织损失较小，卵泡发育质量明显优于模型组。结果见图1。

图1 各组大鼠卵巢组织形态学变化（HE 染色，×200）

2.3.2 护卵汤对DOR 大鼠卵巢组织中卵泡数量的影响 与空白组相比，模型组大鼠卵巢组织中原始卵泡、初级卵泡、窦状卵泡数量均显著减少（P＜0.05，P＜0.01），闭锁卵泡数量显著增加（P＜0.01）。与模型组相比，护卵汤组大鼠卵巢组织中原始卵泡、初级卵泡数量均显著增加（P＜0.05，P＜0.01），闭锁卵泡数量显著减少（P＜0.05）；补佳乐组大鼠卵巢组织中初级卵泡数量显著增加（P＜0.05），闭锁卵泡数量显著减少（P＜0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠卵巢组织中卵泡数量的比较 （个，x±s）

3 讨 论

卵巢是女性重要的生殖器官，是卵子产生和排出的场所；同时又是女性一生中变化最大的内分泌腺体，其激素分泌对女性的经、带、胎、产均有重要的调节作用［8］。随着年龄的增长，女性卵巢功能呈逐步衰退状态，特别是女性年龄到达37 岁以后，卵巢功能急剧下降［9］。若卵巢储备功能减退，不仅会影响卵子的正常排出，导致女性无法受孕；而且会影响女性激素分泌，出现月经不调、闭经、卵巢早衰甚至全身其他系统疾病［10］。国内外流行病学调查以及动物实验研究表明，生育年龄的女性卵巢储备功能降低呈上升趋势，其影响因素涉及遗传、环境、医源性等［11］。也有报道曾称，DOR在人群中的发病率为10%左右［12］，因此，如何充分发挥中医药优势，有效防治DOR 的发生发展，具有非常重要的意义。

近年来，已有大量的临床研究证实，在治疗DOR 的过程中，单独运用中医药或中西药联用，其效果显著优于单独的西药治疗［13-16］。Meta 分析结果也表明，中药联合西药激素在降低促卵泡生成激素（FSH）、改善中医证候方面均显著优于西药激素［17］。护卵汤是全国名老中医尤昭玲教授所创［18］，全方以菟丝子为君，既能滋阴，又能补阳。覆盆子、桑椹子为臣，覆盆子以补阳为主，桑椹子以补阴为主，二者助君，使肾阴得养，肾阳得化，阳中求阴，填精增液，卵子得以生长发育成熟。生、熟地既能补血滋阴，又能补精益髓，为卵泡生长发育提供先天精髓；肉苁蓉补肾阳、益精血，肾阳温煦则卵泡得以孕育成长；铁皮石斛滋肾调肝，润养阴精，定志除惊，调和阴阳，助卵长养；沙参滋补肾阴，健脾益肾；山药、莲肉补肾填精，健脾益气，同补先后天之本，以上药物合用补肾益阴，滋阴增液，合力共助卵泡发育长养。此外，卵泡欲顺势而出，非通经活络之品不能达，月季花归肝经，活血调经，疏通气机、宣散胞脉，气血得宣而走行通畅，有利于卵子顺气血之势而出；莲心清心安神，交通心肾；甘草为使，补脾益气，调和诸药。诸药合用，则肾气盛、精血充，任通冲盛，故在临床中可有效提高卵巢卵泡数量及质量［1］。

从本研究结果可以看出，护卵汤可以显著改善CTX 所致卵巢功能减退模型大鼠的动情周期；增加DOR 模型大鼠双侧卵巢湿重，提高卵巢指数；对卵巢组织形态学改变亦有良性调节作用；并可显著增加DOR 模型大鼠卵巢组织中原始卵泡、初级卵泡数量，降低闭锁卵泡数量。卵巢组织内的卵泡数目能够很好地反映卵泡池中剩余的原始卵泡，是卵巢储备能力常用的主要指标，其中，窦卵泡计数是评估卵巢储备功能的主要指标之一［12，19-20］。综上可以得出，护卵汤可促进CTX 所致DOR 模型大鼠卵巢功能的恢复，其具体作用机制有待于进一步的实验进行探讨。