长链非编码RNA-H19调控人肝癌HepG2细胞增殖与凋亡*

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(1. 右江民族医学院附属医院，广西肝脏疾病临床医学研究中心，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000)

原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC) 是指原发于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，起病隐匿，进展迅速，易转移复发，生存期短，且治疗棘手，许多病例在发现时已属中晚期，能够手术治疗的不到20%[1]，大多数病例主要依靠非手术方法治疗。故非手术方法成为治疗PHC的主要手段，防止复发转移等特殊作用在肝癌治疗中占有不可替代的地位[2-4]。长链非编码RNA(lncRNA)是ncRNA中一类转录本长度超过200nt的RNA分子，主要位于细胞核或细胞质中，参与基因组印记、染色质修饰、基因表达、细胞周期、核内运输等过程的调控[5]，近年分子及基因免疫治疗是PHC防治的重点，随着研究各个方面的深入，人们发现lncRNA在许多肿瘤中异常表达，可影响肿瘤的侵袭转移[6]。本研究拟从细胞水平探讨lncRNA-H19调控肝癌细胞增殖、凋亡作用。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI-1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)为美国Gibco公司产品，四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、胰酶(含EDTA)、1-磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)购自北京索莱宝公司，二甲基亚砜(dimethysulfoxide，DMSO)购自sigma公司，引物购自宝日医生物技术(北京)有限公司(takara中国)、LV3-人类lnRNA-H19(序列5’to3’：GAACACCTTAGGCTGGTGGG)和LV3-NC购自上海吉玛制药技术有限公司；荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒、细胞增殖试验(MTT法)试剂盒和流式细胞检测试剂盒购自美国BD Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染、慢病毒构建 实验分组：①设空白对照组(人肝癌细胞HepG2+培养基)；②阴性对照组(人肝癌细胞HepG2+培养基+空载体)；③沉默组(人肝癌细胞HepG2+培养基+慢病毒)；在37℃、CO2体积分数为5%的培养基中，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，培养人肝癌细胞HepG2。取对数生长期的人肝癌细胞HepG2接种于6孔板，使细胞融合度到达60%时，取阴性对照病毒，按1∶100于培养基混合稀释，总体积约500 μl，并加入终浓度5 μl/ml Polybrene增强转染剂，以人肝癌细胞HepG2作为转染对象，使用慢病毒转染技术沉默人肝癌细胞HepG2的lncRNA-H19表达，24 h后更换新鲜培养基。

采用荧光显微镜观察转染后细胞荧光表达情况，在荧光通道下观察可见>80%细胞均有荧光(见图1)，说明转染效率>80%，该转染条件可应用于后续实验。

1.2.2 RNA提取、逆转录及qPCR试剂 qRT-PCR检测RNA表达水平采用TRIzol法提取总RNA，逆转录得到cDNA，采用qRT-PCR试剂盒进行扩增操作，以GAPDH为内参检测细胞中lncRNA-H19转染前后表达量。采用2-ΔΔCT方法处理qRT-PCR 数据，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 MTT实验 转染后24 h，胰酶消化收集细胞，调整细胞浓度为5×104/ml，取96孔培养板，接种细胞密度为100微升/孔。加入110微升/孔MTT稀释液，37℃，5%CO2孵育2 h，酶标仪检测每孔在490 nm波长处吸光度(A值)。分别于接种细胞后第24 h、48 h、72 h检测，绘制生长曲线。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 取细胞接种于6孔板中(浓度2毫升/孔)。收集培养48 h后的各组细胞，PBS洗涤2次，轻轻加胰蛋白酶处理人肝癌细胞HepG2，2000 r/min，离心5 min，用 PBS洗涤细胞2次；100 μl缓冲液悬浮细胞(密度大约为1×105cells/ml)在细胞悬浮液中加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI 后轻轻混匀，于25℃避光条件下孵育15 min；后再加400 μl缓冲液。利用BD FACS CantoⅡ流式细胞仪检测各组人肝癌细胞HepG2的凋亡率。

2 结果

2.1 H19转染效率的验证 荧光显微镜下观察转染效率，转染的lncRNA-H19带有绿色荧光，因此可以在荧光显微镜下观察转染效率，为荧光通道下观察可见>80%细胞均有荧光，说明转染效率>80%，该转染条件可应用于后续实验，见图1。

图1 荧光显微镜下观察H19转染后细胞荧光表达

2.2 qRT-PCR检测lncRNA-H19的相对表达量 人肝癌细胞HepG2中lncRNA-H19的表达为(3.352±0.209)，转染后对照组和沉默组细胞中lncRNA-H19的表达分别为(2.950±0.109、0.367±0.020)，沉默组的表达降低(F=422.449，P<0.01)，其中空白组及阴性组无明显区别，说明转染慢病毒后人肝癌细胞HepG2中的lncRNA-H19表达得到有效抑制，以下称为沉默组人肝癌细胞株HepG2，见图2。

图2 人肝癌细胞HepG2中lncRNA-H19的PCR相对表达量

注：a、b比较无统计学意义；而c与a、b相比，c：P<0.01

2.3 MTT法检测细胞增殖能力 与对照组相比，沉默组人肝癌细胞株HepG2增殖能力在增强，72 h明显增强(P<0.05)，表明沉默组lncRNA-H19能促进肝癌细胞的增殖能力，抑制人肝癌细胞株HepG2细胞增殖。见表2、图3。

表2 MTT法检测细胞吸光度的表达量

注：空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义；而沉默组与空白对照组及阴性对照组组间两两相比差异均具有统计学意义(P<0.001)

图3 各组MTT法检测细胞吸光度随着时间变化的表达量

注：b、c比较差异无统计学意义；而a与b、c相比差异均具有统计学意义，a：P<0.01

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 低于空白对照组及阴性对照组，凋亡率从低到高顺序为沉默组<阴性对照组<空白对照组，统计学分析显示，各组间差异有统计学意义(F=69.096，P<0.001)，进一步行LSD两两比较结果显示，空白对照组与阴性对照组差异有统计学意义(P<0.05)，其余组间两两比较结果差异有统计学意义(P<0.01)，见表3，表明沉默组lncRNA-H19可抑制细胞的凋亡，促进人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡。

表3 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

注：a：与空白对照组比较，P<0.05；b：与空白对照组比较，P<0.01；c：与阴性对照组比较，P<0.01

3 讨论

LncRNA起初被认为是基因组的“转录垃圾”[7]，不参与生物学功能的调节。然而近年来研究表明，lncRNA通过表观遗传学修饰，广泛调控细胞的增殖、分化、凋亡等多种细胞生物学行为，在肿瘤发生发展中发挥重要的作用[8]。LncRNA已成为当前基因领域研究的热点之一，越来越多的lncRNA被发现与肿瘤的发病机制、复发、转移及预后有一定的相关性[9]。H19作为第一个印记基因被发现，该基因是父系印迹母系表达，位于人类染色体11p15.5的H19 /IGF2的基因簇上。H19 基因编码的一段mRNA样RNA分子中没有明确的开放阅读框，尽管它与mRNA有一样的结构基础(由RNA聚合酶Ⅱ合成，由RNA剪接加工和经过多聚腺苷酸化) ，却不能编码蛋白质产物，而是作为一种特殊的RNA发挥生物学功能[10]，后续研究中将该产物命名为lncRNA-H19。当下lncRNA-H19是研究较多的一种长非编码产物，但其在恶性肿瘤中的作用存在争议。一方面有文献报道lncRNA-H19在胃癌[11]、肺癌[12]、乳腺癌[13]、皮肤癌[14]等一些恶性肿瘤中存在高表达，并且对恶性肿瘤的增殖具有一定的促进作用，但是另一方面，也有文献报道[15-18]lncRNA-H19在肿瘤中的低表达可以抑制恶性肿瘤的侵袭性，另外还有文献报道[19]在早期膀胱癌中高表达，但是其表达水平会随着肿瘤细胞分化降低，恶性程度升高而产生下调。LncRNA-H19[20]是一种尚未明确功能的lncRNA，而近年来，在肝癌中的一些文献报道，Zhang 等[21]研究发现，lncRNA-H19在肝癌组织中的表达低于相对应癌旁正常肝组织，且肿瘤内lncRNA-H19表达量的低比值与肝内转移率及肿瘤包膜的不完整性相关，并伴随较短无复发生存率，是提示肝癌预后不良的独立危险因素。目前多数研究表明lncRNA-H19在实体瘤中发挥促癌作用，可加快肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭，同时抑制细胞凋亡。例如，lncRNA-H19已被证实在卵巢癌细胞系OV90和SKOV3中较正常卵巢细胞明显增高，且加快增殖、抑制细胞的凋亡[22]。另外，还有研究可知[23-24]，在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞及转移性乳腺癌中lncRNA-H19呈现高表达状态，我们知道雌激素可以诱发乳腺癌细胞分化，从侧面证实lncRNA-H19在乳腺癌中起着促癌基因作用。LncRNA-H19作为癌基因发挥作用的机制已被广泛研究，有研究发现[25]lncRNA-H19通过降低抑癌基因let-7的生物利用度，在卵巢癌细胞中还可以促进细胞的迁移和侵袭。然而，有不少研究发现[26-27]lncRNA-H19 在肿瘤中具有抑癌作用，并且已发现在肾母细胞瘤、头颈鳞癌、横纹肌肉瘤等中lncRNA-H19表达下调。LncRNA-H19在肝癌中具有促癌抑癌双重作用，既可促进肿瘤细胞的迁移、侵袭[28]，还可以通过激活miR200抑制晚期肝癌细胞的迁移和侵袭[21，29]。对于lncRNA-H19具有促癌和抑癌双向影响功能的现象，一部分研究者[26]认为由于lncRNA-H19的反义转录序列可以编码HOTS肿瘤抑制核蛋白，所以过表达的HOTS 对绒毛膜癌肿瘤、霍奇金病、横纹肌肉瘤细胞生长起抑制作用。更有学者认为[30]lncRNA-H19存在不同生长阶段组织、不同组织以及同一组织的不同部位的表达和作用机制均有所不同。不管lncRNA- H19是作为癌基因或抑癌基因，在肿瘤中lncRNA-H19存在表达的差异并且参与肿瘤发生发展、侵袭、转移的调控是肯定的。

为了更深一步探究lncRNA-H19对人肝癌细胞株HepG2生物学活动的调控[31]，本研究构建慢病毒转染lncRNA-H19 干扰其空载对照的人肝癌细胞HepG2稳定株，然后为了人肝癌细胞HepG转染前后lncRNA-H19的表达量，采用qRT-PCR的方法检测中人肝癌细胞HepG2中lncRNA H19 转染前后的表达变化，结果显示 lncRNA-H19 在人肝癌细胞HepG2中明显下调，我们通过向HepG2细胞转染siRNA 使lncRNA-H19 表达下调(沉默lncRNA-H19)后来观察HepG2细胞增殖、凋亡的变化。在MTT增殖实验中发现，沉默lncRNA-H19后人肝癌细胞株HepG2细胞增殖能力明显增强，说明lncRNA-H19可以抑制人肝癌细胞株HepG2细胞增殖，其抑制作用72 h>48 h>24 h，表现为时间依赖；沉默lncRNA-H19后，在流式细胞术检测人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡率时发现，转染48 h后实验组较阴性对照细胞凋亡率明显下降，说明lncRNA-H19可以促进人肝癌细胞HepG2凋亡，我们的实验结果进一步表明lncRNA H19可能在肝癌的发生发展中发挥抑癌作用，而高表达lncRNA-H19可能对肝癌具有一定的治疗意义。

目前的研究认为，作为辅助分子参与表观遗传学调控是长非编码的一种主要作用机制。而其他的一些相关文献中已经报道了lncRNA-H19可以作为辅助定位分子参与DNA甲基化和组蛋白乙酰化的过程，调控多种基因的表达，参与影响胚胎的发育及多种疾病的发生。因此，lncRNA-H19对肝癌细胞增殖和凋亡的影响及可能机制值得研究。

综上所述， lncRNA-H19是肝癌细胞凋亡过程中重要的调控因子，沉默lncRNA-H19可显著增强肝癌细胞增殖，抑制其凋亡，表明lncRNA-H19可以调控 HepG2细胞的生长，能抑制肝癌细胞HepG2的增殖，其抑制作用呈时间依赖性，促进HepG2细胞凋亡。lncRNA-H19有望成为潜在的肝癌的基因治疗靶点，但其在体内与体外的作用是否一致及其作用机制，还有待进一步研究。