lncRNA NEAT1在结核分枝杆菌感染RAW264.7巨噬细胞中的表达及作用的初步探讨

黄舒颖，张 诚，黄自坤，罗 清，卿 城

结核病是严重危害人类健康的全球性公共卫生问题。世界卫生组织公布的报告表明，目前全球每年约有150～200万人死于结核病，高居单一病原致患者死亡的感染性疾病之首。我国是结核病高负担国家之一，结核病患病人数居世界第三位[1]。近年来由于耐药菌株的不断增多、人口流动性加大以及HIV的蔓延，使得结核病的防治更加迫在眉睫。结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)是一类胞内寄生菌，主要寄生于感染受体的巨噬细胞内，因此机体抗结核免疫主要依赖于细胞免疫。遗憾的是，对MTB感染后相关免疫反应及免疫逃逸的机制至今尚未阐明，使得结核病的防治至今未再次获得突破性进展。

长链非编码RNA (long-noncoding RNA, lncRNA)是一类广泛存在的长度大于200 nt非编码RNA，缺乏开放读码框，而是利用与RNA、DNA或者蛋白的相互作用，对靶分子进行核酸降解、干扰RNA翻译等方式在转录和转录后水平对细胞的增殖、凋亡、损伤、自噬和分化等生物学过程进行调控，在免疫、肿瘤、心血管[2]等多种疾病中发挥重要作用。lncRNA NEAT1是近期研究发现的一个重要的细胞功能调控因子，在卵巢癌[3]、前列腺癌[4]等肿瘤疾病的形成、分化及转移方面发挥重要作用。重要的是，NEAT1参与了机体固有免疫过程，是体内重要的免疫正向调节因子。在感染性疾病中，NEAT1参与了人体HIV[5]、汉坦病毒[6]、寨卡病毒[7]感染过程。在免疫性疾病系统性红斑狼疮患者单核细胞中发现NEAT1表达上调，进一步研究显示NEAT1可调节THP-1细胞炎症因子白介素6(interleukin-6,IL-6)、CXCL10表达[8]。由于细胞因子IL-6和CXCL10与MTB感染后巨噬细胞炎症反应密切相关，因此，NEAT1可能参与了巨噬细胞抗MTB的免疫过程。该研究采用H37Rv菌株构建感染巨噬细胞模型，检测NEAT1在巨噬细胞中的表达，另一方面利用RNAi 干扰沉默巨噬细胞NEAT1表达，检测H37Rv感染后IL-6表达及其对H37Rv杀菌功能影响，初步探讨NEAT1在结核病免疫反应过程中的作用。

1 材料与方法

1.1材料与主要试剂RAW264.7巨噬细胞购自中国科学院上海细胞研究所；MTB标准菌株H37Rv(ATCC 27294)由本实验室保存；DMEM培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；TRIzol 试剂和LipofectmineTM2000转染试剂均购自美国Invitrogen公司; PCR引物购自上海生工生物工程公司；IL-6 ELISA试剂盒购自上海明睿生物技术有限公司；逆转录试剂盒与荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物TaKaRa公司；siRNA 干扰试剂购自广州锐博公司；荧光定量PCR采用美国ABI公司(Applied Biosystems 7600系统)。其它所用试剂均为分析纯。

1.2感染模型的建立选取对数期生长的RAW264.7巨噬细胞加入24孔板，置于 37 ℃、5% CO2孵箱中培养至细胞贴壁良好后，将H37Rv按一系列感染复数(multiplicity of infection, MOI)对巨噬细胞进行感染，4 h后将胞外未感染的细菌用PBS洗去，然后继续在培养箱中培养(37 ℃、5%CO2)，12 h后TRIzol提取细胞总RNA；或采用MOI=5对巨噬细胞进行感染，并于感染后4 h将胞外未感染的细菌用PBS洗去，然后置于培养箱中培养(37 ℃、5% CO2)，在感染后的不同时间点(12、24、48 h)TRIzol分别提取细胞总RNA，RT-qPCR检测细胞NEAT1表达情况，ELISA技术检测培养上清液IL-6含量。

1.3总RNA提取TRIzlo法提取总RNA，具体参考试剂说明书。

1.4RT-qPCRcDNA逆转录采用TaKaRa公司逆转录试剂盒，所有操作条件按说明书进行。内参GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。NEAT1 上游引物：5′-CTTCCTCCCTTTAACTTATCC-ATTCAC-3′， 下游引物 ：5′ -CTCTTCCTCCACCATTACCAACAATAC-3′[8]； qPCR 反应采用 SYBR Premix EX TaqTMⅡ，使用ABI 7500 系统进行上机，具体的检测步骤及反应条件设置都按照试剂盒说明书进行。所有样品做 3 复孔，RNA相对表达量以 2-ΔΔCt方法计算所得。

1.5IL-6蛋白测定ELISA检测培养上清液IL-6浓度，具体步骤参考试剂盒说明书。

1.6siRNA细胞转染制备NEAT1 siRNA以及control siRNA(siNC)，具体由上海Gene Pharma公司完成。siRNA引物序列[8]：正义序列：5′-GUGAGA AGUUGCUUAGAAACUUUCC -3′，反义序列：5′-GGA AAGUUUCUAAGCAACUUCUCACUU-3′。巨噬细胞分为3组：空白对照组、siNC转染组以及siNEAT1转染组。巨噬细胞贴壁良好后，siNEAT1或siNC转染根据LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行操作，转染后细胞放在孵箱中培养4～6 h后更换完全培养基，转染后24 h收集细胞，TRIzol提取细胞总RNA，RT-qPCR检测siRNA敲减效果。

1.7siNEAT1对巨噬细胞IL-6分泌影响NEAT1沉默后的RAW264.7巨噬细胞，将H37Rv按MOI=5的比例对细胞进行感染，48 h后ELISA法检测细胞培养上清液中IL-6的含量。

1.8siNEAT1对巨噬细胞对H37Rv杀菌功能检测巨噬细胞分为3组：空白对照组、siNC转染组以及siNEAT1转染组；NEAT1沉默后的RAW264.7巨噬细胞，将H37Rv按MOI=5的比例对细胞进行感染，4 h后用PBS洗去胞外未感染的H37Rv，该时间点设为H37Rv感染后0 h。分别于H37Rv感染后0 h、72 h收集并裂解各组细胞，将裂解液进行系列梯度稀释，接种于含有 OADC的7H10固体培养基上，继续培养 3～4周后进行菌落计数。

2 结果

2.1H37Rv感染RAW264.7巨噬细胞后NEAT1表达和IL-6分泌情况如图1所示，MTB感染巨噬细胞后，RT-qPCR检测显示细胞内NEAT1表达显著上调，与空白对照组表达为1.0相比，12、24、48 h分别上调(5.83±1.21)、(5.25±0.98)、(4.62±0.93)倍，差异有统计学意义(F=33.55，P<0.01)。 ELISA检测表明，未感染时细胞培养上清液中IL-6的浓度为(186.43±28.09 )pg/ml，MTB感染48 h后IL-6浓度为(404.29±43.53)pg/ml，差异有统计学意义(t=11.12，P<0.01)。

图1 MTB感染巨噬细胞后NEAT1表达和IL-6分泌情况A：NEAT1；B：IL-6；与空白对照组比较：**P<0.01

2.2NEAT1沉默后巨噬细胞IL-6分泌的变化RNAi转染成功地沉默了巨噬细胞NEAT1表达(t=16.19，P<0.05)，见图2A。将沉默NEAT1的RAW264.7巨噬细胞感染MTB后收集培养上清液，采用ELISA法检测IL-6分泌水平。从图2B可见，正常对照细胞仅少量分泌IL-6 [(142.25±36.43)pg/ml]，感染MTB后分泌量升高[(405.26±23.80)pg/ml]，差异有统计学意义(t=12.08，P<0.01)。沉默NEAT1后的巨噬细胞，与转染对照序列细胞(siNC)比较， IL-6分泌量显著减少(t=4.45，P<0.01)。

图2 ELISA检测NEAT1沉默后感染MTB的RAW264.7巨噬细胞IL-6分泌量变化

A：NEAT1；B：IL-6；与空白对照组比较：**P<0.01；与siNC组比较：#P<0.05

2.3NEAT1沉默后巨噬细胞对H37Rv杀菌能力的影响以空白敲除组作为对照组，敲低NEAT1的RAW264.7细胞为实验组，分别感染H37Rv，0.1%SDS裂解细胞并接种于7H10固体培基，最后检测荷菌量。结果显示，H37Rv感染后0 h时，siNEAT1组与对照组细胞荷菌量差异无统计学意义(t=1.03，P>0.05)，提示沉默NEAT1对巨噬细胞吞噬MTB功能无明显影响。以0 h时间点胞内MTB量为基准，在MTB感染后72 h时，与对照组比较，siNEAT1处理组巨噬细胞中MTB的存活率显著上升(t=8.98，P<0.01)，见图3，提示沉默NEAT1表达可显著抑制RAW264.7巨噬细胞清除胞内MTB的能力。

图3 siNEAT1对RAW264.7细胞杀伤H37Rv影响的检测结果与siNC 72 h组比较：**P<0.01

3 讨论

lncRNA已被证实广泛参与多种人类疾病的调控。lncRNA THRIL[9]参与巨噬细胞内TNF-α基因转录和蛋白分泌；lncRNA Cox2[10]可调控巨噬细胞内NF-κB与Toll样受体信号通路，影响炎症因子干扰素、趋化因子的表达等。此外，lncRNA在结核病免疫反应过程中的作用也逐渐引起了关注。例如lncRNA CD244可从表观遗传水平调控结核感染过程中CD8+ T细胞IFN-γ和TNF-α分泌[11]。lncRNA MEG3敲除的巨噬细胞，其BCG清除能力显著提高[12]。

NEAT1又称为MENε /β或 VINC，是从人类第11号染色体上一个被称为多发性内分泌瘤病(MEN)Ⅰ型的基因位点，由 RNA聚合酶Ⅱ转录生成，具有高度的人鼠同源性[13]。NEAT1有NEAT1-1(约3 700 bp)和NEAT1-2(约2 300 bp)两个亚型。已有的研究[8]显示，NEAT1-1是巨噬细胞的主要表达成分。因此本研究中直接选取检测巨噬细胞中 NEAT1-1表达进行相关研究。

NEAT1参与了机体的固有免疫反应调控，是一个重要的促炎分子。Zhang et al[14]发现NEAT1在 HIV-1 感染患者的 T细胞中表达上升，敲除NEAT1 则会促进 HIV-1 mRNA从细胞核到细胞质的出核与转运过程，进而促进HIV-1病毒的复制。汉坦病毒感染人脐静脉内皮细胞也会引起NEAT1表达升高，转染上调NEAT1可活化RIG-I/IRF7信号通路，促进炎症因子IFN分泌[6]。Zhang et al[8]研究发现脂多糖(LPS)刺激可提高巨噬细胞内NEAT1的表达水平，高表达的NEAT1可通过调控JNK/ERK MAPK信号通路影响巨噬细胞内炎症因子的表达。然而，目前尚未见有关NEAT1在结核病中的研究报道。

由于MTB是胞内寄生菌，在其感染机体后主要寄生于巨噬细胞内，因此抗结核免疫研究最终还是要落实到巨噬细胞上来[15]。为了明确NEAT1在MTB感染中的作用，本研究首先采用RT-qPCR技术检测了RAW264.7巨噬细胞在感染H37Rv后细胞NEAT1的表达。结果表明，MTB感染会诱导显著上调NEAT1在巨噬细胞中表达，同时IL-6分泌增加。这可能是由于免疫细胞感染MTB后，首先会迅速激活巨噬细胞，并促进包括IL-6在内的多种促炎因子释放，增强机体对MTB的杀伤能力，阻止其广泛播散。最近研究[11]表明NEAT1可通过调控JNK/ERK MAPK炎症信号通路影响巨噬细胞内炎症因子的表达。因此，在实验过程中检测NEAT1沉默后巨噬细胞IL-6分泌量变化。结果显示，siRNA敲除NEAT1后，使 IL-6分泌量下调。进一步通过胞内细菌计数实验显示，敲除NEAT1后可显著减弱RAW264.7巨噬细胞对MTB的胞内清除能力，进一步证实了NEAT1参加MTB感染后的免疫过程。

综上所述，本研究显示MTB H37Rv感染RAW264.7巨噬细胞后细胞内NEAT1表达显著升高，炎症因子IL-6分泌增加；沉默NEAT1会抑制巨噬细胞对MTB的清除能力。本研究提示NEAT1在结核病免疫反应过程中发挥了重要作用，为结核病免疫治疗提供了新的线索。