家蚕5龄幼虫体腔注射维生素C对相关代谢的影响

徐 欣 刘中文 卜黎明 宋 松 张英华 王嘉祯 朱绪伟

(河南省蚕业科学研究院，河南郑州 450008)

维生素C(vitamin C，VC)，又称为抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)，其与脱氢抗坏血酸(dehydroascorbate，DHA)在酶的作用下形成一个氧化还原系统[1]，具有抗氧化作用，并参与许多生物代谢[2]。在家蚕体内，VC是重要的必需营养物质[3-5]，能够刺激家蚕摄食[6]，因此在生产上是一些桑叶添加营养剂的重要组成部分，也是家蚕人工饲料中的重要添加物[7]。为进一步了解外界添加VC对家蚕幼虫生长发育的影响，我们通过体腔注射不同剂量的VC溶液，观察家蚕生长、化蛹、结茧等生理变化，并结合注射后家蚕体内VC含量的变化，确定家蚕可承受的添加剂量；同时，根据杨洋等[8]研究中的家蚕VC合成代谢关键酶——L-古洛糖酸-γ-内酯氧化酶(L-gulono-γ-lactoneoxidase，GULO)的基因序列(BmGULO-like1和BmGULO-like2)进行表达量的半定量RT-PCR分析，以了解注射VC后家蚕体内VC含量和生长发育变化的分子机理，阐述相关代谢变化的原因，为研究家蚕添食VC提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 家蚕品种 菁松×皓月，由河南省蚕业科学研究院繁育提供。

1.1.2 饲养桑叶 采自河南省蚕业科学研究院桑园，5年生湖桑32号夏伐前的桑叶，桑园土质为黄棕壤，桑树种植行距为1.2 m，株距为0.8 m。

1.1.3 主要试剂 VC，粉剂，纯度99%，Sigma公司产品；苯基硫脲，粉剂，纯度97%，上海源叶生物科技有限公司产品；抗坏血酸测定试剂盒，总蛋白定量测定试剂盒，均为南京建成生物工程研究所产品；动物组织总RNA提取试剂盒(离心柱型)、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(去基因组)、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖、GeneGreen核酸染料，均为天根生化科技(北京)有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 UV2600紫外可见分光光度计，岛津仪器(苏州)有限公司产品；TGL16M高速冷冻离心机，湖南湘立科学仪器有限公司产品；9200型PCR仪，Applied Biosystems公司产品；1600凝胶成像仪，上海天能科技有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 家蚕5龄1 d幼虫体腔注射不同浓度的VC溶液 设置VC注射剂量梯度为每克家蚕0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg。将VC粉末溶于0.9%的NaCl溶液中分别配制成VC浓度为0.004、0.008、0.016、0.032、0.064 mg/μL的溶液，选取生长状况相近的5龄1 d的家蚕幼虫，每头家蚕的体质量约2 g，用微量进样器进行体腔注射，每头家蚕分别注射VC溶液5 μL，对照区注射同体积的0.9%的NaCl溶液。对照区和5个处理区分别注射100头家蚕。

1.2.2 家蚕生长发育情况的观察与调查 观察注射后家蚕5龄期和蛹期生长发育情况，调查各个处理区5龄经过、结茧率、死笼率、虫蛹率、全茧量、茧层量、茧层率。

1.2.3 家蚕体内VC含量的测定 根据上述家蚕生长发育调查的结果，选择家蚕每克体质量注射剂量为0.01、0.02 mg的处理区，测定家蚕血淋巴和全蚕体的VC含量。分别在注射后0、1、6、12、24、48、72、96 h共8个时间点进行取样，每个血淋巴和全蚕体样本各取5头家蚕，在常温下用玻璃匀浆器对全蚕体进行匀浆处理，取样时在血淋巴和蚕体匀浆中加入少量的97%的苯基硫脲粉剂防止氧化，每个样品重复3次，处理后将样品置于-20 ℃冰箱中备用。然后，按照抗坏血酸测定试剂盒的操作步骤进行操作，其中全蚕体样品提前按照测定试剂盒说明书测定匀浆蛋白浓度，最后用紫外可见分光光度计进行VC含量测定。

1.2.4 半定量RT-PCR测定VC代谢关键酶基因表达量变化 昆虫幼虫的脂肪体与肝脏功能相当，是主要的储能场所，也有较高的抗坏血酸含量[9]。选取VC合成代谢的关键酶基因BmGULO-like1和BmGULO-like2进行相对表达量变化检测，根据1.2.3的结果选择对6个处理组注射后1 h和6 h共2个时间点的家蚕脂肪体进行取样调查，每个样品取5头家蚕幼虫脂肪体，取出后用液氮处理，放在1.5 mL无盖离心管中并用铝箔纸包裹，置于液氮罐中暂时保存备用。根据动物组织总RNA提取试剂盒(离心柱型)说明书的步骤，在常温下并配合使用高速冷冻离心机提取家蚕脂肪体RNA供试，用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(去基因组)合成cDNA，再用2×Taq PCR MasterMix进行半定量RT-PCR测定。 根据目的基因的cDNA序列，使用Primer 5.0程序设计符合半定量RT-PCR试验的特异性引物，内参基因选择柞蚕肌动蛋白基因(ApA)，其扩增的引物序列为ApA-F(5′-CCAAAGGCCAACAGAGAGAAGA-3′)和ApA-R(5′-CAAGAATGAGGGCTGGAAGAGA-3′)；BmGULO-like1基因扩增的引物序列为BL1-F(5′-GCTCTTGGAGAAAGCGATTG-3′)和BL1-R(5′-CCCGCACTCTGTCGTAAAGT-3′)；BmGULO-like2基因扩增的引物序列为BL2-F(5′-GAGGGCCGTTAAAGAGATCC-3′)和BL2-R(5′-CCAAGTGTAGCGTCAACCAA-3′)。扩增程序如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环后，再72 ℃延伸10 min。

1.3 数据处理与分析

PCR产物在TAE电泳缓冲液中，以1.2%琼脂糖凝胶电泳0.5 h，经GeneGreen核酸染料染色后在凝胶成像仪下观察拍照。基因的相对表达水平以其PCR产物电泳条带和ApA基因PCR产物电泳条带的积分光密度(Integrated Optical Density，IOD)比值表示。所有的试验均重复3次，试验数据采用SAS 9.0数据分析软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 家蚕5龄1 d幼虫体腔注射不同剂量的VC对生长发育的影响

从表1可以看出，在一定剂量范围内，注射VC能明显缩短家蚕的5龄经过，茧层率也有所提高，每克体质量注射剂量为0.02 mg的家蚕结茧率和虫蛹率比对照高，说明添加一定量的 VC能促进家蚕的生长发育，是否能够提高家蚕的抗逆性，还需要进行进一步的试验验证。但是，注射剂量较高时，每克体质量注射剂量为0.04 mg和0.08 mg的家蚕结茧率、全茧量等多个指标都比对照差，尤其是每克体质量注射剂量为0.16 mg的家蚕5龄经过延长较多，推测与注射高剂量的VC扰乱了家蚕体内VC代谢有关，这在后面的基因表达量试验中也得到了验证。其中，每克体质量注射剂量为0.08 mg的家蚕死笼率降低，每克体质量注射剂量为0.16 mg的家蚕各指标有所改善，可能与结茧率低和个体差异有关。

表1家蚕5龄1d幼虫体腔注射不同剂量的维生素C(VC)的生长发育情况

每克家蚕VC注射剂量/mg5龄经过/(d:h)结茧率/%死笼率/%虫蛹率/%全茧量/g茧层量/g茧层率/%09:1495.003.1692.002.030.5125.120.019:1193.002.1591.002.010.5426.870.029:0196.002.0894.002.050.5526.830.049:0991.004.4087.001.950.4925.130.089:2088.002.2786.001.930.4623.830.1610:1293.003.2390.002.010.5426.87

2.2 家蚕5龄1 d幼虫体腔注射不同剂量的VC对血淋巴和蚕体VC含量的影响

根据前期生长发育试验的结果，注射低剂量的VC能够促进家蚕生长，而对于促进作用主要是怎么影响蚕体内VC代谢的，我们进行了注射不同剂量VC后多个时间点家蚕体内VC含量的测定试验，来了解蚕体的一系列变化。图1结果显示，注射不同剂量的VC后1 h家蚕血淋巴VC含量变化应为注射引起；6 h后注射组VC含量较对照组有所提高，由于血淋巴是蚕体生化反应的主要场所，此时是注射后促进家蚕体内VC代谢的主要时间段，这一结果与家蚕生长发育试验的结果一致；提高的效果在注射VC后72 h消失，这可能与蚕体内VC分解代谢增加、合成代谢减少有关，使蚕体VC代谢趋于稳定，后期可以通过测定家蚕体内VC相关代谢酶活性变化进行验证。

图1 家蚕5龄1 d幼虫每克体质量注射不同剂量VC的血淋巴VC含量变化

图2为蚕体总VC含量变化，其与血淋巴变化不同，1 h直接影响过后，VC含量均呈下降趋势且在6 h处理组VC含量高于对照组，这应该与注射VC的影响未消失有关；6 h后注射组较对照组的VC含量有所降低，可能与注射VC抑制体内VC合成途径有关；至96 h时3组数值相差不大，说明处理组蚕体通过自身调节达到体内VC平衡。蚕体VC含量测定的是单位蛋白质内的VC含量，注射组含量比对照组低可能与其血淋巴含量较高有关，不规律变化可能与蚕体VC代谢调节有关，侧面说明血淋巴VC含量测定结果较准确，更能反映VC对蚕体生理变化的影响。

图2 家蚕5龄1 d幼虫每克体质量注射不同剂量VC的家蚕体内VC含量变化

2.3 半定量RT-PCR检测BmGULO-like1和BmGULO-like2基因表达量变化

BmGULO-like1和BmGULO-like2基因是家蚕VC合成代谢的关键酶基因，通过半定量RT-PCR的方法检测体外注射VC对其表达量的影响，来了解额外添加VC引起的家蚕相关基因表达量的变化，试验结果如图3-4所示。从检测结果可以看出，2个基因在5龄早期相对表达量相差不大，在注射1 h后表达量变化明显，到6 h后处理组与对照组相差不大；同时，注射较低剂量的VC能够显著促进2个基因的表达，说明注射较低剂量的VC能够加快家蚕体内VC的合成，符合VC能够提高蚕体抗性的功能；当家蚕每克体质量注射剂量为0.04 mg时VC合成代谢的关键酶基因表达量开始下降，可能是体外注射较高剂量的VC产生了拮抗作用，抑制了VC的合成，对于体外注射较高剂量的VC对家蚕体内VC的分解代谢是否有影响还需要进一步试验证明；注射过高剂量的VC(每克体质量注射剂量高于0.16 mg)，2个基因表达量在6 h后仍然显著升高，可能是引起了代谢紊乱所致，与前面注射高剂量VC的家蚕虫蛹率比对照低，死笼率比对照高的结果一致。

*表示与对照区存在显著差异，**表示与对照区存在极显著差异；图4相同。图3 家蚕5龄1 d幼虫每克体质量注射不同剂量VC的BmGULO-like1基因相对表达量

图4 家蚕5龄1 d幼虫每克体质量注射不同剂量VC的BmGULO-like2基因相对表达量

3 小结与讨论

本次试验采用体外注射的方法给家蚕幼虫添加VC，能够较直接地观察其对家蚕的影响，试验结果发现，家蚕每克体质量注射剂量为0.02 mg能够促进家蚕幼虫的生长发育、提高抗性，使血淋巴VC含量提高，VC合成代谢关键酶基因的表达量显著升高，是较合适的注射剂量，为幼虫期营养添加等方面研究提供了参考。注射高剂量的VC会引起家蚕产生一系列应激反应，由于注射大量的VC，家蚕体内的VC含量剧增，家蚕为将其还原需消耗过多的氧化物质，从而导致家蚕体质下降、抗性减弱，以至于结茧率、虫蛹率、全茧量、茧层量等多个指标都较对照差，试验结果中VC合成关键酶基因的表达量显著升高也是VC代谢紊乱的一种表现。