加减枇杷清肺饮对ICR小鼠痤疮模型NLRP3炎性小体及其下游因子的影响❋

陈 茜，刁庆春，韩晓凤，王思平，江 雪，陶春蓉

(重庆市中医院,重庆市第一人民医院皮肤科,重庆 400011)

寻常痤疮是最常见的皮肤疾病之一，目前患痤疮的青少年占80%以上,成人痤疮有上升趋势，其中18～37岁的女性痤疮患病率约为23.4%～43.7%[1-2]。寻常痤疮是一种多因素所致的炎症性疾病，主要表现为面部和躯干上部的粉刺、丘疹、脓疱、结节、囊肿等，部分患者可导致严重的瘢痕，严重影响患者的容貌及身心健康[3-5]。而存在于毛囊皮脂单位中的痤疮丙酸杆菌是痤疮的主要致病因素。NLRP3是NOD 样受体(NLR)家族的成员，其在体内的表达水平及其在不同疾病状态中的研究已成为热点。NLRP3激活后与衔接分子ASC及效应分子Pro-Caspase-1形成炎性小体，形成成熟的Caspase-1，Caspase-1是最具特征性的促炎反应蛋白，可进一步加工处理细胞因子IL-1β前体产生IL-1β,引起机体炎症反应[6]。已有研究显示，NLRP3炎性小体参与痤疮的发病机制，痤疮患者皮损中NLRP3、Caspase-1及IL-1β均呈增加趋势，临床中加减枇杷清肺饮治疗寻常痤疮疗效较好。本次研究利用痤疮丙酸杆菌建立ICR小鼠痤疮模型，初步探索了加减枇杷清肺饮对NLRP3炎性小体及其下游因子Caspase-1和IL-1β的影响。

1 材料

1.1 主要仪器与试剂

酶标仪购自普朗；荧光定量PCR仪购自罗氏公司；细胞裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、β-actin抗体均购自碧云天生物技术研究所；ECL化学发光试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTM、RT-PCR逆转录试剂盒购自TAKARA公司;NLRP3、caspase-1、IL-1β一抗购自abcam公司;辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠、山羊抗兔二抗购自Santa公司；所有引物均合成于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 实验动物

6～8周龄雌性ICR小鼠36只，体质量35～45 g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供。实验条件为SPF级饲养，采用架式笼养，正常给予水和食物，室内饲养温度(25±1)℃，湿度50%～60%。

1.3 痤疮丙酸杆菌混悬液制备

痤疮丙酸杆菌(中国药品生物制品检定所，ATCC6919)厌氧条件4 ℃保存。混悬液制备时取痤疮丙酸杆菌菌株1株，在脑心浸液培养基中37 ℃转种活化并增殖，收集菌落洗涤过滤，PBS调整痤疮丙酸杆菌浓度(1×108CFU/20 μL)。

1.4 实验药物

四环素混悬液制备,四环素片(山西云鹏制药有限公司生产)每片剂量0.25 g，根据使用说明书使用。按体表面积折算小鼠等效剂量为每日0.126～0.257 g/kg，据此确定阳性对照药四环素组给药剂量为每日0.126 g/kg。每次灌胃前均临时配制四环素混悬液，配置方法：将剂量1片0.25 g 的四环素研磨成粉末倒入烧杯中，加入50 ml蒸馏水混匀，配置为浓度5 mg/ml的四环素悬浊液。

加减枇杷清肺饮组成：枇杷叶15 g，桑白皮15 g，黄芩15 g，栀子15 g，薏苡仁20 g，白花蛇舌草20 g，忍冬藤20 g，连翘12 g，郁金15 g，夏枯草15 g，丹参12 g，皂角刺10 g，山楂10 g，甘草6 g，方剂总量为200 g。根据“人与各种动物之间药物剂量换算表”计算小鼠等效剂量为25.90 g/kg/d，参考已报道的文献及等比原则[7]，加减枇杷清肺饮高剂量、中剂量、低剂量分别为51.80、25.90、12.95 g/kg/d。严格称量方剂中的各味中药，加蒸馏水进行煎煮浓缩为2 g/ml，加蒸馏水配制成高(2 g/ml含生药量)、中(1 g/ml含生药量)、低(0.5 g /ml含生药量)不同剂量的中药液，以高温蒸汽法将制备后的水煎液进行灭菌处理，并置于-20 ℃冰箱备用。

2 方法

2.1 动物分组

ICR小鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为PBS对照组、模型组、四环素组、中药高、中、低剂量治疗组6组各6只。

2.2 造模建立及治疗方法

除PBS对照组外，其余各组给予痤疮丙酸杆菌混悬液20 μl，右耳内侧同一部位皮内注射共1次。PBS对照组给予PBS20ul皮内注射。除PBS对照组及模型组外，其余各组动物在造模1 d后开始灌胃给药治疗，PBS对照组及模型组每日灌胃1 ml生理盐水。四环素组按剂量每日0.126 g/kg灌胃给药，加减枇杷清肺饮高、中、低剂量组分别给予1 ml中药液灌胃，每日灌胃1次，各组均连续治疗7 d。治疗完成后，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，取耳部皮损组织及血液，采集标本后断颈处死各组动物。

2.3 观测指标及方法

2.3.1 肉眼观察ICR小鼠耳部皮损变化 各组小鼠干预完成后肉眼观察小鼠耳部皮损变化情况，记录炎症、脓肿等相关变化。

2.3.2 HE染色后光镜下观察组织病理变化 各组小鼠干预完成后取耳部皮损，10% 中性甲醛液固定脱水、石蜡包埋、切片，HE 染色，在光镜下观察各组皮损处皮肤病理学特点。

2.3.3 Real-time PCR检测NLRP3、caspase-1、IL-1β转录水平 表1显示，取皮损后TRIZOL法提取组织总RNA，并逆转录成cDNA。再以cDNA为模版，Real-time PCR实时检测荧光强度。Real-time PCR的反应体系为：SYBR© Premix Ex TaqII(2×)6.25ul，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，cDNA 1 μl，dH2O(sterile distilled water)4.25 μl，总体积为12.5 μl。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5s，60 ℃ 30 s，40个循环；溶解曲线95 ℃ 5s，60 ℃ 1min，95 ℃ 1s，冷却50 ℃ 30 s。

表1 RT-PCR引物序列

2.3.4 Western blot检测NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白水平 提取耳廓皮损总蛋白，BCA法测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离(80 V 30 min;120 V 60 min)，湿转法转到PVDF膜(100 V 90 min)，5%脱脂牛奶封闭1 h，分别按比例配制一抗NLRP3、caspase-1、IL-1β、β-actin，于4 ℃孵育过夜，次日TBST洗7 min×4次，二抗室温孵育1 h。TBST洗7 min×4次，加入现配制发光液于C-Digital western曝光仪上曝光。利用ImageJ软件对条带进行灰度分析。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 ICR小鼠耳部痤疮模型肉眼观察结果

图1显示，PBS对照组肉眼观察小鼠耳薄、柔软，其上毛细血管清晰可见；模型组造模后耳部出现明显红肿，1周后耳廓脓肿更加明显；四环素组治疗1周后小鼠炎症明显减轻，耳廓脓肿、脓疱及丘疹等大部分消退；加减枇杷清肺饮高、中、低剂量组治疗后炎症、脓肿均有不同程度减轻，以高剂量组疗效最明显。

注：a.PBS对照组；b.模型组；c.四环素组；d.加减枇杷清肺饮低剂量组；e.加减枇杷清肺饮中剂量组；f.加减枇杷清肺饮高剂量组图1 治疗1周后各组ICR小鼠耳部皮肤观察结果比较

注：a.PBS对照组；b.模型组；c.四环素组;d.加减枇杷清肺饮低剂量组；e.加减枇杷清肺饮中剂量组；f.加减枇杷清肺饮高剂量组图2 各组ICR小鼠耳部组织炎症改变比较(HE ×200)

3.2 各组ICR小鼠耳部组织病理改变

图2、3显示，PBS对照组和四环素组耳部真皮内稀疏单一核细胞浸润，真皮上部散在少许皮脂腺腺体；模型组真皮内炎症细胞弥漫性浸润，间质充血水肿，皮脂腺增生明显；加减枇杷清肺饮高、中、低剂量组炎症浸润、间质充血水肿及皮脂腺增生均有减轻，以高剂量组减轻最明显。

注：a.PBS对照组；b.模型组；c.四环素组；d.加减枇杷清肺饮低剂量组；e.加减枇杷清肺饮中剂量组；f.加减枇杷清肺饮高剂量组图3 各组ICR小鼠耳部组织皮脂腺腺体改变比较(HE ×200)

3.3 Real-time PCR检测结果

表2显示，与PBS对照组比较，模型组NLRP3、caspase-1、IL-1β的mRNA水平明显增加(P<0.05)；与模型组比较，四环素组，中药各剂量组NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA水平均有下降，但只有四环素组以及加减枇杷清肺饮中、高剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 不同组别NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA及蛋白表达

注：与PBS组比较:*P<0.05； 与模型组比较:#P<0.05

3.4 Western blot检测结果

图4表2显示，与PBS对照组比较，模型组NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白水平明显增加(P<0.05)；与模型组比较，四环素组、加减枇杷清肺饮各剂量组NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白水平均有下降，但只有四环素组及加减枇杷清肺饮中、高剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

注：①对照组；②模型组；③四环素组；④加减枇杷清肺饮低剂量组；⑤加减枇杷清肺饮中剂量组；⑥加减枇杷清肺饮高剂量组图4 各组ICR小鼠caspase-1、IL-1β、NLRP3蛋白表达比较

4 讨论

寻常痤疮属于中医“肺风粉刺”“粉刺”等范畴。加减枇杷清肺饮是笔者临床治疗痤疮的常用方，临床疗效较好。枇杷清肺饮源自《医宗金鉴·卷六十五》：“肺风粉刺肺经热……宜内服枇杷清肺饮，枇杷清肺饮：人参、枇杷叶、甘草、黄连、桑白皮、黄柏”[8]。加减枇杷清肺饮中去掉原方中的黄连、黄柏、人参，加入黄芩、栀子、薏苡仁、白花蛇舌草、忍冬藤、连翘、郁金、夏枯草、丹参、山楂、皂角刺。加减枇杷清肺饮紧扣痤疮发病中肺经热盛这一主要病机，以枇杷叶、桑白皮共为君药清泻肺热为主；黄芩、栀子为臣药，黄芩能清热燥湿、泻火解毒、凉血止血，尤善于清肺火及上焦之实热；栀子能泻火除烦、清热利湿、凉血解毒、消肿止痛，共助君药清肺之功；以薏苡仁、白花蛇舌草、忍冬藤、连翘、郁金、夏枯草、丹参、山楂、皂角刺等共为佐药，佐助君臣清热除湿解毒、活血散结、排脓消痈，甘草为使调和诸药。

寻常痤疮为多因素所致的炎症性疾病，痤疮丙酸杆菌(P.acnes)为诱发痤疮炎症过程的重要因素，是革兰氏阳性厌氧菌，是正常皮肤菌群之一，但在痤疮患者的毛囊皮脂腺中其数量明显增加[9]。ICR小鼠耳廓皮内注射P.acnes，24 h后耳廓出现严重的红斑肿胀，表现出典型的炎症症状[10]。痤疮炎症是宿主对P.acnes的免疫反应，以固有免疫应答为其特征。固有免疫系统中核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体(NLRs)是一类重要的胞内模式识别受体(PRR)，可以识别微生物分子及危险信号，触发炎症和抗微生物反应。NLRP3是NLRs家族成员之一，NLRP3激活后与衔接分子ASC及效应分子Pro-Caspase-1形成炎性小体和成熟的Caspase-1，成熟的Caspase-1进一步将Pro-IL-1β剪接成成熟的IL-1β，从而引起机体的炎症反应及疾病的发生[6]。已有研究显示，NLRP3炎性小体参与痤疮的发病机制，痤疮患者皮损中NLRP3、成熟的Caspase-1及IL-1β均增加；P.acnes在人皮脂腺细胞、单核细胞/巨噬细胞中均能激活NLRP3炎性小体，活化caspase-1，诱导IL-1β分泌；沉默NLRP3或者阻断caspase-1后，均能抑制IL-1β的分泌；钾离子外流、ROS生成、细胞吞噬、溶酶体破裂及蛋白酶表达等均参与P.acnes刺激的NLRP3激活、Caspase-1成熟及随之而来IL-1β分泌；抗IL-1β或靶向NLRP3炎性小体成分治疗能阻止P.acnes引起的皮肤炎症反应[11-13]。

本研究采用P.acnes诱导的ICR小鼠耳部痤疮炎症模型，加减枇杷清肺饮进行干预治疗。实验结果显示，NLRP3炎性小体参与了P.acnes诱导的ICR小鼠耳部痤疮炎症的形成；加减枇杷清肺饮能减轻痤疮模型的炎症，减少皮脂腺增生，降低NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA及蛋白的表达，说明加减枇杷清肺饮可以有效改善痤疮的炎症及皮脂腺增生，抑制NLRP3炎性小体的激活及其下游因子IL-1β分泌可能是其作用机制。

本研究初步探索了加减枇杷清肺饮对NLRP3、caspase-1、IL-1β的影响，为阐明加减枇杷清肺饮治疗痤疮的作用机制奠定了基础，但痤疮发病机制复杂，加之加减枇杷清肺饮成分较多，究竟是方中何种成分起的作用，以及是通过何种途径抑制NLRP3炎性小体的激活尚不清楚，同时是否还对痤疮发病的其他环节有干预作用，均有待进一步的研究。