探讨常规HPV检测采用RNA优势于DNA检测的临床意义

马 莉,陈建国,吴白平

(1.青海省第五人民医院 检验科，青海 西宁810007;2.湖南省肿瘤医院 检验科，湖南 长沙410013)

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤之一，近年来，我国宫颈癌发病率持续上升[1]。宫颈癌早期无症状或症状不明显，癌瘤生长速度缓慢，在其达到机体出现明显症状、体征之前要经过相当长的时间，故临床前来就诊的患者往往癌肿已到晚期。早期筛查与早期诊断是宫颈癌发病的二级预防措施，能有效减低宫颈癌死亡率[2]，从而及时给予患者有效的治疗。国内外最新研究表明，高危型HPV的持续感染在宫颈癌发生发展过程中扮演了重要角色[3]，HPV mRNA E6、E7在致癌机制中的作用则是现在的研究重点[4-6]。本研究通过检测不同患者HPV E6/E7 mRNA与HPV DNA的表达水平，评价此两项指标的检测意义。

1 资料与方法

1.1一般资料选取湖南省肿瘤医院检验科于2016年1月-2016年12月收治的因宫颈疾病行宫颈活检的200例患者资料，病例纳入标准：(1)所有患者既往均无急性生殖道炎症；(2)所有患者均未接受盆腔放射治疗及化学治疗；(3)所有患者均无其他系统重大疾病 ；(4)所有患者均了解实验相关情况，并签署知情同意协议。收集各组患者资料，根据病理活检结果将其分为4组，包括低级别宫颈上皮内瘤变患者(低级别组)50例，年龄23-65岁，平均(41.3±8.5)岁；高级别宫颈上皮内瘤变患者(高级别组)50例，年龄24-64岁，平均(41.9±9.2)岁；宫颈浸润癌患者(浸润癌组)50例，FIGO分期为Ⅰa1-Ⅲb期，年龄35-66岁，平均(42.1±9.0)岁；其他良性妇科疾病患者50例作为对照组，年龄23-66岁，平均(41.8±8.9)岁。4组患者两两比较，其一般资料相比无统计学意义。

1.2方法

1.2.1标本采集 使用细胞专用刷与患者宫颈管旋转收集宫颈口及宫颈管脱落的上皮细胞，置于含有专用细胞保存液的试管中保存待检。

1.2.2HPV E6/E7 mRNA检测 采用河南科帝亚生物技术有限公司生产的 HPV E6/E7 mRNA检测试剂盒，按说明书所示规范进行实验操作：将待检标本液置于低温离心机，以3 000 r/min的速度离心10 min后，弃去上层液体，加入裂解液和蛋白酶K，65℃孵育约1.5 h，中途振荡混匀标本2次，间隔30 min。将初步处理完成的待检样本加入96孔板，设立空白对照与阳性质控各2孔，加入捕获探针，孵育30 min，再加入底物及底物催化剂，孵育30 min。经冷光仪检测目的mRNA数量，单位为拷贝数，拷贝数>0为阳性。

1.2.3HPV DNA检测 采用美国Digene公司生产的HPV DNA检测试剂盒，按说明书所示规范进行实验操作：将待检标本液置于低温离心机，以3 000 r/min的速度离心10 min后，弃去上层液体，加入裂解液A，70℃孵育1 h，弃去上清液，90℃水浴5 min后冰浴5 min，3 000 r/min离心5 min，取沉淀加入反应液，37℃孵育30 min。将初步处理完成的待检样本加入96孔板，设立空白对照与阳性质控各2孔，加入捕获探针，孵育30 min，再加入底物及底物催化剂，孵育30 min。经冷光仪检测出目的DNA的数量，单位为拷贝数，拷贝数>0者为阳性。

1.3观察指标

记录各组HPV E6/E7 mRNA检测与HPV DNA检测的阳性例数与平均拷贝数，两两进行比较分析，根据其统计学意义进行方法评价。

1.4统计学方法

采用SPSS17.5统计软件进行数据分析，计量数据用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1HPVE6/E7mRNA检测结果见表1，由表中数据可见，与对照组相比，低级别组，高级别组，浸润癌组HPV E6/E7 mRNA阳性例数与拷贝数明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与低级别组相比，高级别组与浸润癌组HPV E6/E7 mRNA阳性例数与拷贝数明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组HPV E6/E7 mRNA检测结果

注：与对照组相比，AP<0.05；与低级别组相比，BP<0.05。

2.2HPVDNA检测结果见表2，由表中数据可见，与对照组相比，低级别组，高级别组，浸润癌组HPV DNA阳性例数与拷贝数明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与低级别组相比，高级别组，浸润癌组HPV DNA阳性例数与拷贝数无明显差异，差异不具有统计学意义(P>0.05)。

表2 各组HPV DNA检测结果

注：与对照组相比，AP<0.05；与低级别组相比，CP>0.05。

3 讨论

我国每年约有15万宫颈癌新发病例，每年约有8万人死于宫颈癌，其死亡率居妇科肿瘤的第二位。近年来，宫颈癌新发病例数持续上升，并呈年轻化的趋势。经过大量流行病学和病毒学研究证实，宫颈组织发生癌前病变直至发展为浸润性癌症与高危型人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染有关。HPV DNA检测有助于发现患者HPV的持续感染，辅助宫颈癌及其癌前病变的早期诊断。但多数患者HPV感染具有一过性的特点，而从HPV感染至宫颈上皮细胞内瘤变通常需数年至数十年的病变发展，因此实际工作中，HPV DNA检测用于预测宫颈疾病恶化风险的效果并不理想。国外相关研究表明，HPV mRNA检测和HPV DNA 检测阳性似然比分别为1.1-1.9和 2.0-5.8，与HPV DNA检测阳性的结果相比，mRNA 检测阳性提示患者发生宫颈病变的几率更高。

在癌变发展过程中，HPV DNA需要首先被激活，转录大量的E6/E7 mRNA，然后再由mRNA翻译成相应的癌蛋白。在宫颈癌的发展过程中，E6/E7过量表达将导致HPV DNA侵入宿主DNA后产生E6蛋白与E7蛋白，E6蛋白与抑癌蛋白P53结合，阻断细胞凋亡，而E7蛋白与抑癌蛋白视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)结合，促使细胞无限增殖而癌变[7-9]。李剑[10]等在其研究中发现，宫颈上皮细胞发生高危型HPV病毒的感染时，E6/E7癌基因处于复制活动期，病灶组织病变处于转化的活跃期，此时，免疫组织化学染色结果可见镜下病灶组织E6/E7蛋白全视野弥漫阳性。低危型HPV E6/E7蛋白在阻碍p53和pRb功能方面不如高危型的E6/E7蛋白强烈，与这一现象相关的机制尚未阐明，但国内外学者一直认为低危型HPV感染可能仅与良性增生相关[11,12]。作为一个新的生物标记，E6/E7 mRNA的大量表达是细胞发生高级别病变的一个信号，相比于HPV DNA，E6/E7 mRNA与宫颈癌癌变的相关性更好，也越来越受到各方的关注。

由我们的实验可见，与低级别组相比，高级别组与浸润癌组HPV E6/E7 mRNA阳性例数与拷贝数明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。但HPV DNA检测，低级别组，高级别组，浸润癌组HPV DNA阳性例数与拷贝数两两相比，差异不具有统计学意义(P>0.05)。这与国内外相关研究结果一致[13,14]。综上所述，相比于HPV DNA检测，HPV E6/E7 mRNA在不同级别的宫颈上皮内瘤变患者检测中具有更好的敏感性，提示HPV E6 /E7 mRNA更适用于评估宫颈疾病恶化风险。