风羊腿微生物特征及其对风味特性的影响

张佳敏，王卫，吉莉莉，白婷，陈林，刘达玉

(成都大学 药学与生物工程学院，四川 成都，610106)

中国的羊肉制品历史悠久，包括腌腊、酱卤、烧烤等多个类型近百种产品，其中风羊腿是最有代表性的传统腌腊肉制品之一，产品以羊腿为原料，经修整、上盐、腌制、自然风干、贮藏成熟等工序加工而成，加工期在30 d以上[1-3]。对中国传统腌腊肉制品的研究表明，在自然风干及贮藏过程中，肉品原料会发生一系列有利于风味形成的理化及微生物变化，尤其是在风干环节，随着水分的降低，还伴随着脂肪和蛋白质的分解、氧化等反应，逐渐产生醛、酮、酸等一系列小分子化合物，从而形成产品独有的风味特征[4-5]。对发酵肉制品的研究显示，在发酵过程中微球菌和非致病性葡萄球菌中含有丰富的蛋白酶和脂肪酶，可将蛋白质和脂肪分解为氨基酸和脂肪酸，对产品风味形成产生重要影响，即使是在中式腌腊肉制品中，这一基于微生物的风味形成途径对于缓慢风干的产品也不可或缺[6-7]。目前已有关于利用微生物发酵剂的方式提升中国传统腌腊制品风味和品质，缩短发酵期，实现安全性可控的研究报道，如刘晓强等[8]利用筛选出的戊糖片球菌、变异微球菌、木糖葡萄球菌和乳酸菌用于火腿，以改善风味，降低亚硝酸盐残留；蒋云升等[9]采用微生物发酵制作兔肉发酵制品以提升产品中游离氨基酸含量；王卫等接种促进风味形成为主导的发酵微生物，如肉色葡萄球菌、木糖葡萄球菌等的复合菌种，加工出符合中式消费习惯的腊肠和腊肉等肉制品，显著提升产品风味[10]，对风羊腿中微生物的特征及其风味特性目前尚缺少系统研究。

Biolog-ECO微生物分析系统是一种通过监测微生物对不同碳源底物利用程度，用以描述微生物群落特征的快速、简便的方法，由于Biolog分析法可实现大范围、快速、自动化和标准化的微生物检测，已被广泛应用于土壤、水质中微生物群落分析[11-13]，以及环境修复效果评价等方面，但其应用范围还较窄[14-15]，特别是在食品领域应用很少，目前在中式发酵食品中的应用主要为探究泡菜和酒曲中微生物多样性[16-17]。本研究将其应用于腌腊肉制品，以自然风干法和添加微生物发酵剂风干法加工风羊腿，采用Biolog-ECO微生物分析系统对产品中微生物群落的代谢特征以及多样性特征进行分析，并结合气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)进一步对产品中挥发性风味物进行检测，探究微生物调控对产品微生物群落和风味特性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜带皮羊腿：四川北牧南江黄羊集团有限公司；SM-194冻干菌，复合菌种为肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌、清酒乳杆菌和汉逊德巴利酵母菌(Staphylococcuscarnosus，Staphylococcusxylosus，Pediococcuspentosaceus，Lactobacillussakei，Debaromyceshansenii)，德国Chr. Hansen公司。

电子天平(TJA3130N)，上海民桥精密科学仪器有限公司；水浴锅(DZKW-4)，北京中兴伟业仪器有限公司；微生物鉴定系统Biolog-ECO，MicroStation；气相色谱/质谱联用仪，美国安捷伦；拍打式匀浆机(XY-05)，宁波新艺超声设备有限公司；微量加样器(100-1000)，瑞士索科；生化培养箱(LRH-250)，上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 风羊腿制作

(1)产品配方

传统自然风干组(A组)：以整只羊后腿为原料，每1 000 g肉料添加食盐70 g、亚硝酸钠0.1 g、D-异抗坏血酸钠0.8 g、葡萄糖5.0 g、八角2 g、花椒4 g。

添加微生物发酵菌组(B组)：添加SM-194冻干菌，其他与A组相同。

(2)制作工艺

修整→上盐→入缸腌制(4 ℃，12 d，其间上下翻动3～4次)→清洗晾挂→自然风干(至脱水15%)→修割整形→发酵风干(8～12 ℃，相对湿度50%～65%，18 d，至失重30%～32%)→切段、真空包装→贮藏、后发酵(6～8 ℃，30 d)→成品

1.3 检测指标及方法

1.3.1 基于Biolog-ECO法的微生物特性分析

在Biolog-ECO平板上有96个微孔，包含3组相同的碳源配置，每组包含1个空白对照和31份不同类型的单一碳源以及相同含量的四唑紫染料(tetrazolium violet, TV)。微生物在利用碳源过程中产生的自由电子与染料发生还原显色反应，利用颜色反映的浊度差反映微生物对碳源的利用程度[18]。

在风羊腿中段深入表皮1 cm下取样，将肉样剪碎后，加入生理盐水(0.9 %的NaCl)225 mL，用拍打式均质机均质5 min后取1 mL均质液，用生理盐水稀释100倍后，取稀释的悬浊液加入Biolog-ECO平板，每孔为15 μL。将平板置于30 ℃培养箱中培养，每隔24 h用酶标仪测定96个孔在590 nm和750 nm下的吸光度[18-19]。微生物对碳源的代谢强度用平均吸光度(average well color development，AWCD)表示，计算公式为：

(1)

式中：A590,反应孔590nm时的吸光度；A750,反应孔750nm时的吸光度。

微生物对各类碳源的代谢强度采用吸光度分率表示[20]，其定义式为：

(2)

(3)

式中：Pi,第i种碳源的吸光度分率；Pj,第j类碳源的平均吸光度分率；nj,第j类碳源的数目。

采用丰富度指数(S)来评估微生物物种的丰富度，即被微生物利用的碳源总数，为每孔中(A590～A750)的值大于0.25的孔个数[21]；采用Shannon-Wiener指数(H′)来表示系统中微生物的功能多样性，H′值定义见公式(4)[18]；采用均匀度指数(E)来表示群落实测多样性与最大多样性的比率，E值定义见公式(5)[19]；采用Simpson指数(D)来说明最常见种的优势度，D值定义见公式(6)[19,21]。

H′=-∑Pi·lnPi

(4)

E=H′/Hmax=H′/lnS

(5)

(6)

1.3.2 挥发性风味成分测定

参考TABANELLI等[22]的方法，并稍作修改。在风羊腿中段深入表皮1 cm下取样，将肉样剪碎后，准确称取3.0 g粉粹均匀的样品，放入15 mL顶空瓶中密封，采用动态顶空制样。GC-MS分析图谱经计算机和人工把每个峰同时与NIST library和Wiley Library相匹配检索定性，匹配度和纯度大于800(最大值1 000)作为定性分析结果。对化合物进行定量分析时，对总离子流量色谱图用峰面积归一化法定量，得出各组分的相对含量。

固相微萃取条件：固相微萃取头CAR/PDMS 75 μm(美国SUPELCO公司)；萃取温度：80 ℃；萃取时间：40 min；解吸时间：3 min；仪器条件：HP 6890/5973 GC/MS(美国安捷伦科技有限公司)；色谱柱：HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：250 ℃；分流比：2∶1；升温程序：起始温度50 ℃，保持3 min，以每分钟5 ℃升至150 ℃，再以每分钟10 ℃升至260 ℃；离子源：EI；电离能量：70 EV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；质量扫描范围：20～450 amu。

2 结果与分析

2.1 微生物代谢活性分析

基于Biolog-ECO法的微生物特性分析结果，传统自然风干组(A组)和添加微生物发酵剂组(B组)的AWCD变化曲线如图1所示。AWCD曲线的变化速率反映了微生物的平均代谢活性，AWCD值增加越快，表明微生物的平均代谢活性越高[15]。由图1可见，2组产品的AWCD曲线大致都包含了停滞期、对数生长期和稳定期3个阶段，总体变化趋势为前24 h微生物活性低，24～48 h开始升高，48～72 h趋于平缓，72 h后显著升高，144 h后进入平稳阶段。对比2组风羊腿的微生物活性强弱可看出，B组的AWCD值在前72 h低于A组，但72 h后B组的AWCD值显著升高，微生物代谢活性大大高于A组。在发酵初期代谢活性不及自然风干组，而在培养72 h后，B组的菌群代谢活性大大提高，因而AWCD曲线增长明显加快，且显著高于A组，在144～168 h的平稳阶段，B组的代谢活性约为A组的1.7倍。由此可见，所添加的微生物发酵菌在经过适应期后，其代谢活性大大高于原生菌群，菌种的作用效果需经较长时间的发酵方可显现。

图1 风羊腿AWCD变化曲线Fig.1 Change of AWCD value of goat ham

2.2 微生物特征分析

Biolog-ECO平板碳源分为聚合物类、氨基酸类、酯类、醇类、胺类、酸类6大类，微生物对各类碳源的代谢能力采用吸光度分率表示，用以分析微生物对不同种类碳源的代谢特性[21]。分析得到2组产品微生物对6类碳源代谢能力的平均吸光度分率如图2所示。

图2 两组风羊腿微生物对6类碳源的利用特征Fig.2 Changes in AWCD for six substrate categories of two groups of goat ham

由图2可见，各类碳源的平均吸光度分率均随时间的延长而增强，B组对6类碳源的利用强度整体较高，尤其是对醇类和酸类物质的代谢强度，在整个培养期内都高于A组。而其他几类碳源的代谢情况是在培养96～120 h后方才表现为B组高于A组。

2.3 微生物多样性分析

单一系统中微生物群落特性可以用Shannon-Wiener指数(H′)、均匀度指数(E)以及Simpson指数(D)等来表征，用以反映微生物群落功能多样性的不同侧面[18,20]。丰富度指数S为群落中总的物种数，Shannon-Wiener指数H′是反映丰富度和均匀度的综合指标，其包含着2个成分：种数(species)和各种间个体分配的均匀性(evenness)，种数越多，各种之间个体分配越均匀，H′值就越大[23]。以2组样品微生物代谢强度曲线达到快速增长期，即96 h时的AWCD进行比较分析，结果如表1所示。

表1 两组风羊腿微生物群落多样性指数Table 1 Diversity indices of microorganism communitiesin two groups of goat ham

2组产品的差异主要体现在丰富度指数S和多样性指数H′上，B组的丰富度指数S和多样性指数H′均高于自然风干组，说明2组产品在多样性上的差异主要是由物种数量上的差异造成的，B组产品由于添加了微生物发酵剂，且添加的菌种在后期贮藏过程中较好地适应了产品内环境，显示出较强的代谢活性，从而增加了样品中微生物的丰富度和多样性，而2组产品的菌群在均匀度指数E和Simpson指数D差异不大。

2.4 挥发性风味成分分析

采用GC-MS分析法对2组羊腿中挥发性风味物质测定结果见图3和表2，2组产品风味物种类对比见图4。

图3 风羊腿挥发性风味成分总离子流图Fig.3 The TIC of volatile flavor components of goat ham

就风味物相对含量比较，A组含量最高的为醇类(34.433%)和酸类(28.225%)，其次分别为醛类(8.392%)、酮类(6.405%)、烯烃类(4.733%)、酚类(2.476%)、酯类物质未检出(0.000%)；B组含量最高的为醇类(39.179%)和醛类(23.779%)，其次分别为酸类(16.144%)、烯烃类(7.980%)、酯类(4.685%)、酮类(5.892%)、酚类(0.230%)。而从生成的风味物种类分析，A组依次为：酸类(8种)>醇类(5种)>醛类(4种)>烯烃类(3种)=酚类(3种)>酮类(2种)>酯类(0种)；B组依次为：醛类(13种)>醇类(8种)=酸类(8种)>酯类(5种)>酮类(3种)>烯烃类(2种)=酚类(2种)。A组共检出25种，B组共检出41种，结合微生物代谢特征和多样性检测分析结果，添加发酵剂的产品中挥发性风味成分的种类极显著多于传统风干组，显然与其菌群具有较高的微生物代谢活性有密切关联，微生物发酵剂对风羊腿风味物质形成具有促进作用，这与王卫等[10]在微生物发酵剂对四川腊肠和腊肉风味影响的研究中的结果相符。

表2 风羊腿挥发性风味物质比较Table 2 Comparison of volatile flavor of goat ham

续表2

种类化合物名称相对百分含量/%A组B组醛类2-Undecenal 2-十一碳烯醛-0.551Benzaldehyde,4-(1-Methylethyl) 4-异丙基苯甲醛-0.525Pentadecanal 十五醛0.688-Hexadecanal 十六醛-0.14总量8.392(4种)23.779(13种)酮类2-Butanone,3-hydroxy 3-羟基-2-丁酮2.7013.5422-Cyclohexen-1-one,3-methyl-6-(1-methylethyl)2-羟基-6-甲基-3-(1-甲乙基)-2-环己烯-1-酮3.704-2,3-Octanedione 2,3-二酮-2.0613,5-Octadiene-2-one 3,5-二烯酮-0.289总量6.405(2种)5.892(3种)酸类Acetic acid 乙酸22.8169.973Butanoic acid 丁烷酸2.1320.22Pentanoic acid 戊酸0.12-Hexanoic acid 己酸-0.878heptanoic acid 庚酸1.902-Caprylic acid 辛酸0.8450.15Nonanoic acid 壬酸0.162.543Decanoic acid 癸酸0.132.032-Decenal,(Z) 顺,2-癸酸-0.21dodecanoic acid 十二酸0.12-Hexadecanoic acid 十六酸-0.14总量28.225(8种)16.144(8种)酚类Phenol 苯酚0.110.125Phenol,3-methy 3-甲基-苯酚-0.105Phenol,4-methyl 4-甲基-苯酚0.15-Eugenol 丁香油酚2.216-总量2.476(3种)0.230(2种)酯类Ethyl Caprylate 辛酸乙酯-2.5323-Cyclohexen-1-ol,4-methyl-1-(1-methylethyl)2-甲基-丙酸-1-甲基-1-(4-甲基-3-环己烯-1-基)乙酯-0.14Ethyl Caprate 癸酸乙酯-1.748Tetradecanoic acid,ethyl ester 肉豆蔻酸乙酯-0.155Hexadecanoic,ethyl ester 棕榈酸乙酯-0.11总量0(0种)4.685(5种)总风味物种类数25种41种

注：“-”表示未检测出。

对产品中各类风味成分进行分类分析比较，醇类物质在A组中检测到5种，在B组中检测到8种，2组中均检测到的物质为乙醇、正戊醇、沉香醇、α,松油醇和苯甲醇；添加了发酵剂的B组产品α，松油醇和苯甲醇含量较A组有所提升，此外还检测出了1-己醇、2-辛烯-1-醇和正辛醇。醇类物质中的不饱和醇阈值较低，对风味的形成产生一定贡献[25]。

醛类化合物主要来自于脂肪氧化和降解[24]。醛的阈值一般很低，具有脂肪香味，是肉香味的主要成分[25]。A组产品中检测出了4种醛类化合物，总量为8.392%，其中主要为壬醛，含量为7.234%；B组产品中检测出了13种醛类化合物，总量为23.779%，与A组相比，醛类化合物的种类和含量均得到提升，其中己醛是亚油酸的主要氧化产物，苯甲醛是苯丙氨酸的降解产物[26]，它们对整体风味的形成起着重要作用，说明微生物对提升醛类化合物含量具有较强的促进作用。

酸类物质在2组产品中均检测出8种，总量分别为28.225%和16.144%，主要为乙酸，但B组乙酸含量与A组相比大大降低，结合微生物对碳源的利用情况分析，可能与微生物对酸类底物的利用强度较高有关。酯类物质在A组中未检出，在B组中检出5种，以辛酸乙酯和癸酸乙酯为主，具有果香和酒香香气，对风味有促进作用。对比可见，添加了微生物发酵剂的B组产品酸类物质有所降低，而酯类物质含量得到提升。烯烃类化合物及酚类化合物2组产品之间差异不大。

图4 挥发性风味物质种类Fig.4 Varieties of volatile flavor compounds

3 结语

采用基于Biolog-ECO微生物分析系统的微生物特征分析，以及GC-MS对挥发性风味物的检测，比较了添加或不添加微生物发酵剂对自然风干发酵的风羊腿微生物特性和风味的影响。结果表明，SM-194微生物发酵剂对风羊腿的AWCD值产生显著影响，尽管在发酵初期添加发酵剂的产品微生物代谢活性略低，但随发酵风干期的延长显著升高，且对6类碳源的利用强度也整体高于对照组的原生菌群，对风羊腿中底物的分解能力更强，尤其对促进酯类物质的形成效果更佳。

微生物多样性分析表明，添加微生物发酵剂组的多样性指数H’和丰富度指数S均高于对照组，而均匀度指数E和优势度指数D差异不明显。进一步的风味物种类和含量检测结果显示，添加微生物发酵剂后，风羊腿的风味物种类达到41种，而未添加组仅为25种，尤其是在醇类、醛类及酯类物质的种类和含量上，添加微生物发酵剂组均更为丰富，其中，醇类物质增加了3种，醛类物质增加了9种，酯类物质检测出5种，而未添加发酵剂的产品未检出酯类物质。

传统自然风干腌腊肉制品在工艺和产品特性上可归结为发酵肉制品类型，风干发酵进程中微生物的参与，尤其是微生物种类和含量对产品的特有风味的形成具有重要的作用。结果表明，微生物发酵剂对自然风干腌腊肉制品微生物多样性的提升，显然有益于产品风味物成分的形成。而且随着发酵贮藏期的延长SM-194微生物发酵菌所显现的作用才会更加显著。