血清4型禽腺病毒fiber-2基因在昆虫细胞中的表达及其免疫原性分析

梅 梅，陆吉虎，张雪花，唐应华，卢 宇，侯继波*

(1.江苏省农业科学院 动物免疫工程研究所，江苏 南京210014；2.江苏省农业科学院 国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京210014；3.扬州大学兽医学院 教育部禽类预防医学重点实验室/江苏省动物预防医学重点实验室，江苏 扬州225009；4.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009)

I群禽腺病毒(Fowl adenovirus group I)是一类能够感染鸡、鸭、鹅、火鸡、鸽等多种禽类的DNA病毒[1]，感染鸡的I群禽腺病毒包含12个血清型，其中血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4)致病力强，能引起鸡的心包积液综合征(Hydropericardium syndrome，HPS)，病鸡常表现食欲不振、羽毛粗乱、嗜睡等症状，死亡率30%～90%[2-3]；剖检病变常以心包积有淡黄色液体、肝脏出血为主[4]。近年来，我国山东、安徽、吉林、辽宁、湖北、江西、江苏等地大面积暴发该病，给我国养鸡业造成严重的经济损失[5-6]，然而目前尚无商品疫苗及有效预防措施[7]。

FAdV-4为无囊膜病毒，表面呈二十面体对称[8]，fiber-2蛋白是病毒表面重要结构蛋白，由尾部、茎部和头部组成[9]，fiber-2蛋白与细胞表面受体结合，以协助病毒粒子进入细胞，其对病毒毒力及组织拓扑性有着重要的影响[10]。因此，本研究拟利用杆状病毒表达系统和悬浮培养工艺克隆和表达FAdV-4 fiber-2蛋白，并对其进行初步的免疫效力评价，为研制FAdV-4亚单位疫苗研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 FAdV-4由本实验室分离并保存；Bac-to-Bac表达系统购自Invitrogen公司；Sf9细胞、High Five细胞均为本实验室保存；pMD19-T质粒、TaqDNA聚合酶、DNA Marker、T4连接酶均购自TaKaRa公司；质粒小提质粒试剂盒、Agarose Gel DNA Extraction Kit、BAC基因组提取试剂盒购自Qiagen公司；转染试剂盒、FITC标记羊抗鸡IgG(IgG-FITC)、HRP标记羊抗鸡IgG(IgG-HRP)购自Invitrogen公司；FAdV-4阳性血清、DH10Bac感受态细胞、疫苗增强剂CVCVA5由本研究室制备；SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物公司，并由本实验室孵化出雏。

1.2 病毒基因组提取和fiber-2基因的扩增 根据NCBI登录的FadV-4纤突(fiber-2)基因序列(HQ709232.1)设计1对特异性引物：F-F1：5'-TATA ACTAGTATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACA/F-F2：5'-TATTTTCGAATTACGGGAGGGAGGCCGC TGGACA-3'。参考文献[4]提取FadV-4基因组，以其为模板采用Touch-down PCR扩增fiber-2基因。PCR反应条件为：95℃5 min；95℃60 s、64℃60 s、72℃90 s，10个循环；95℃60 s、62℃60 s、72℃90 s，10个循环；95℃60 s、60℃60 s、72℃90 s，10个循环后，72℃10 min。

1.3 重组杆状病毒rBV-fiber-2的构建 将PCR扩增获得的fiber-2基因与杆状病毒转移载体pFastBac1连接后构建重组杆状病毒转移载体pFastBac1-fiber-2，经酶切并测序鉴定。

将鉴定正确的重组杆状病毒转移载体pFast-Bac1-fiber-2转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，构建重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-fiber-2，经蓝白斑筛选3代，提取质粒后，利用特异性引物F-F2/通用引物M13经PCR鉴定。

将重组穿梭质粒rBacmid-fiber-2转染Sf9昆虫细胞，27℃培养120 h或至出现细胞病变(CPE)后，收集细胞和培养上清，4℃，1 000 r/min，离心5 min，收获上清，4℃避光保存，即为第一代重组杆状病毒rBV-fiber-2。

1.4 重组杆状病毒rBV-fiber-2的间接免疫荧光(IFA)鉴定 将获得的重组杆状病毒rBV-fiber-2感染Sf9细胞，96 h后吸去上清，PBS洗涤，4%多聚甲醛室温固定后，以FAdV-4阳性血清(1∶200)为一抗，以羊抗鸡IgG-FITC(1∶400)为二抗，IFA检测重组病毒中fiber-2蛋白的表达；同时设野生杆状病毒(BV-WT)感染的Sf9和正常Sf9细胞为阴性对照。

1.5 重组杆状病毒的western blot鉴定 将重组杆状病毒rBV-fiber-2感染Sf9细胞96 h，收获细胞和上清，1 000 r/min，离心5 min，取10 μL上清经SDS-PAGE电泳检测后，以FAdV-4阳性血清(1∶400)为一抗，以羊抗鸡IgG-HRP(1∶2 500)为二抗，western blot法检测重组fiber-2蛋白的表达；同时设野生杆状病毒(BV-WT)感染的Sf9细胞为阴性对照。

1.6 重组杆状病毒rBV-fiber-2的TCID50测定 将重组杆状病毒rBV-fiber-2按10倍倍比稀释(101～109)后感染96孔板中长成单层的Sf9细胞，每孔100 μL，每个稀释度重复8孔，27℃培养120 h，4%多聚甲醛室温固定30 min，经1.5的IFA测定并经Reed-Muench法计算病毒效价。

1.7 重组fiber-2蛋白琼脂扩散试验(AGP)效价的测定 将悬浮细胞该密度调整至1×106个/mL，将重组杆状病毒MOI 1接种High Five细胞，27℃，170 r/min，摇床培养96 h，超声裂解，1 000 r/min，离心5 min，收获上清，即为重组fiber-2蛋白。

将fiber-2蛋白10倍倍比稀释(21～25)后，采用AGP进行效价测定，同时设PBS和野生杆状病毒BV-WT作阴性对照。

1.8 重组fiber-2蛋白免疫原性试验 按照常规方法将重组fiber-2蛋白制备成油乳剂灭活疫苗。将SPF鸡分成3组，第一组为重组fiber-2油乳剂疫苗组，第二组为fiber-2油佐剂疫苗配伍免疫增强剂CVCVA5组，均经颈部皮下注射，免疫剂量均为0.5 mL/只，第三组为生理盐水对照组。分别于免疫后14 d、21 d、28 d采血测定各组鸡血清抗体AGP效价。

2 结果

2.1 重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-fiber-2的鉴定结果 将fiber-2基因克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1中构建重组杆状病毒转移载体pFast-Bac1-fiber-2，经酶切、测序鉴定正确后将其转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中构建重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-fiber-2，利用PCR对其进行鉴定。结果显示，获得的目的条带大小约1 500 bp，与预期相符(图1)。表明正确构建了重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-fiber-2。

图1 重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-fiber-2的PCR鉴定结果Fig.1 Identification of recombinant baculoviral shuttler plasmid rBacmid-fiber-2 by PCR

2.2 重组杆状病毒的IFA鉴定结果 将重组杆状病毒rBV-fiber-2感染Sf9细胞后经IFA检测。结果显示，rBV-fiber-2感染的Sf9细胞呈现亮绿色荧光，野生杆状病毒感染的Sf9细胞和正常Sf9细胞均无亮绿色荧光(图2)，表明正确构建了重组杆状病毒rBV-fiber-2，且FAdV-4fiber-2基因在Sf9细胞中得到了表达。

2.3 重组杆状病毒的western blot鉴定结果 将重组杆状病毒rBV-fiber-2感染Sf9细胞后采用western blot鉴定。结果显示，rBV-fiber-2感染的Sf9细胞上清在约62 ku处出现一条特异性的蛋白条带，与预期相符，阴性对照未出现相应大小的条带(图3)，进一步表明正确构建了重组杆状病毒rBV-fiber-2，FAdV-4 fiber-2蛋白在Sf9细胞中得到正确表达，且具有较好的反应原性。

2.4 重组fiber-2蛋白AGP效价测定结果 采用AGP检测经悬浮细胞制备的重组fiber-2蛋白的效价，结果显示当重组蛋白稀释度为21～24时均可以与FAdV-4阳性血清产生可见沉淀线，而稀释度为25的重组蛋白孔、PBS对照孔和野生杆状病毒对照孔均未产生沉淀线(图4)。表明重组fiber-2蛋白与FAdV-4阳性血清发生特异性免疫反应，且AGP效价为1∶16。

图2 重组杆状病毒的IFA鉴定结果Fig.2 Identification of fiber-2 in Sf9 cells by IFA

图3 重组杆状病毒的western blot鉴定结果Fig.3 Identification of fiber-2 by western blot

图4 AGP测定重组fiber-2蛋白的效价Fig.4 Titer of fiber-2 tested by AGP

2.5 免疫后SPF鸡血清抗体AGP效价测定结果采用AGP检测免疫后SPF鸡血清抗体效价。结果显示，fiber-2油佐剂疫苗组和fiber-2油佐剂疫苗配伍增强剂组90%的SPF鸡均可以产生特异性抗体，且随免疫时间的延长，其血清抗体AGP效价升高。免疫后28 d，fiber-2油佐剂疫苗组SPF鸡血清抗体AGP平均效价达4.6 log2(1∶24)，fiber-2油佐剂疫苗配伍增强剂组SPF鸡血清抗体AGP平均效价达6.7 log2(1∶104)，阴性对照组SPF鸡血清抗体与灭活抗原无反应，不产生沉淀线(图5)。表明重组fiber-2蛋白具有较好免疫原性，免疫增强剂CVCVA5可以加强该重组蛋白的免疫原性，且当抗原AGP效价达1∶16时，可有效诱导机体抗体的产生。

图5 免疫沉淀试验测定血清抗体AGP效价Fig.5 Titer of sera tested by AGP

3 讨论

I群FAdV-4 fiber蛋白是其主要结构蛋白，通过非共价键与病毒五邻体蛋白结合，展示于病毒粒子表面；fiber蛋白包括fiber-1和fiber-2两个亚基[11]。研究表明，fiber蛋白与病毒毒力相关[12]，其通过与细胞受体的相互作用，及其在病毒衣壳与宿主细胞间的粘附过程中发挥重要的作用[13-14]。fiber-2蛋白被认为是具有保护性的免疫原，其具有诱导中和抗体产生的能力[15-16]，产生的中和抗体能够对腺病毒感染提供有效的保护[15]。

杆状病毒表达系统和悬浮细胞放大培养工艺技术，具有抗原表达快、产量高的优点，表达的蛋白与天然蛋白功能相似。因此，本研究通过杆状病毒表达系统构建和表达I群FAdV-4 fiber-2蛋白，利用悬浮放大培养工艺大量表达该重组蛋白，表达的fiber-2蛋白经IFA、western blot鉴定，结果显示重组fiber-2蛋白与FAdV-4阳性血清能发生特异性免疫反应，蛋白分子量大小62 ku左右，与2014年Schachner A表达的重组fiber-2蛋白大小相近[15]。本研究中，通过AGP检测fiber-2重组蛋白效可达1∶16，表明本研究所用悬浮细胞放大培养工艺制备的fiber-2蛋白含量较高，足以同阳性血清发生特异性反应并产生肉眼可见抗原抗体反应沉淀线，这一结果在其他研究公开发表论文中未见报道。

以重组fiber-2蛋白为抗原免疫SPF鸡，利用AGP于免疫后14 d可检测到特异性抗体的产生，免疫后28 d特异性抗体平均AGP效价达1∶24。血清抗体的分泌表明重组蛋白抗原进入机体后能够有效刺激机体免疫系统快速产生免疫应答，证明杆状病毒表达系统表达的重组fiber-2蛋白具有较好的免疫原性，且产生的抗体能够与FAdV-4发生特异性抗原抗体反应，产生肉眼可见沉淀物，进一步表明抗原有效刺激免疫系统并产生了较高水平的特异性抗体。配伍免疫增强剂组SPF鸡抗体平均AGP效价可达1∶104，与单独油佐剂疫苗组差异显著，表明本研究中配伍的免疫增强剂能显著提高重组fiber-2蛋白的免疫效力，促进机体免疫应答，提高抗体分泌水平。

综上，本研究结果表明重组fiber-2蛋白具有较好免疫原性，其不仅可以作为FAdV-4亚单位疫苗候选抗原，同时重组fiber-2蛋白的表达也为深入研究FAdV-4的致病机理提供基础材料。