高效毛细管电泳法同时分离检测六种地龙多肽＊

周鑫悦，张诗琪，林 露，陈 莉，李 琦，赖 昕，余丽双

（福建中医药大学药学院 福州 350122）

地龙又名蚯蚓，为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum(E. Perrier)，通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen，威廉环毛蚓Pheretima guillelmil(Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen 的干燥体，相传因用其治疗宋太祖赵匡胤的带状疱疹和哮喘而得名“地龙”，是一种传统的中药材。地龙性寒味咸，具有降压、平喘、通络、利尿、解热镇痛抗炎等多种功效[1-2]且应用广泛，近年来常用于中药制剂、注射剂及保健品中。地龙富含蛋白质和多肽，干体中含量高达56%-66%[3]，地龙多肽种类繁多，功能各异。据报道，目前已从地龙中分离得到抗菌肽[4-6]、催产素相关肽[7]、镇痛抗炎肽[8]等多种多肽，例如地龙多肽Annectocin 是从赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）中分离得到的一种催产素- 加压素相关肽（oxytocin-vasopressin-related peptide），具有增强肠道的自发收缩、肾脏的脉动收缩及膀胱摇动，诱导产生陈规定型产卵行为的作用[7-9]；PTP是一种从蚯蚓全身中分离出的对前肠的自发性收缩显示出强烈兴奋作用的多肽[10]；F-1 和OEP3121 是从蚯蚓中纯化出的有抗菌作用的抗菌短肽[5，6]。AQ-5、VQ-5 是从赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）的体腔液中分离得到的两种新的镇痛抗炎肽[8]。现代药理研究表明，地龙多肽具有抗菌抗炎[5-6,8]、调节免疫[11]、降血脂血压[12-13]等多种生物活性，因此有必要对地龙多肽进行研究测定。

目前分离检测多肽最常用的方法有高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）和毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）。高效液相色谱分辨率较高，常用于多肽的纯度鉴定及纯化。多肽分离分析常用的高效液相色谱法有：反相高效液相色谱法、离子交换色谱、体积排挤色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、多维高效液相色谱、液相色谱与质谱联用法等[14]。舒一梅等[15]采用制备型反相高效液相色谱（RP-HPLC），使用A 液：5%乙腈（含0.05%TFA），B 液：95%乙腈（含0.05%TFA）为流动相，对离子交换层析分离后的猪股骨中的高活性组分进一步分离。刘佳佳等[16]采用A 液：0.1%甲酸和B 液：0.1%甲酸乙腈作为流动相，进行梯度洗脱，建立了牛奶中杆菌肽、粘杆菌素A、粘杆菌素B、维吉尼霉素和万古霉素5 种多肽类抗生素的反相液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）检测方法，并对实际牛奶样品进行了检测，重复性良好。胡朝暾等[17]采用高效液相色谱-质谱考察家福捕鸟蛛粗毒中的多肽和蛋白质的多样性，分离得到40多个色谱峰，经质谱鉴定得到238个多肽。

毛细管电泳是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。毛细管电泳兼有电泳和色谱技术的双重优点，克服经典色谱分辨率低、柱效低等缺陷[18-19]。随着毛细管电泳的不断发展，毛细管电泳越来越多地应用到小分子多肽的分离分析中。分离多肽常用的毛细管电泳模式有：毛细管区带电泳（CZE）和毛细管胶束电动色谱（MEKC）等。与高效液相色谱相比，毛细管电泳具有分析时间短，分离效果好，样品用量少，有机试剂用量少，绿色环保，水相分离模式多，非常适合分离极性较大的成分等优点。例如陈均志等[20]用高效毛细管电泳（HPCE）无胶筛分方式（MEKC）成功地分离和检测了微波复合酶法大豆蛋白水解物中的多肽。王辰等[21]利用高效毛细管电泳法分析了脑蛋白水解物中的多肽组分且可有效地分析比较注射液中脑蛋白水解物的多肽组分。薛洪宝等[22]用毛细管电泳法直接同时定量了15 种氨基酸及2 种多肽，经方法学验证，其线性范围宽、相对标准偏差低、精密度高、重现性好，且应用于玉米幼苗样品中氨基酸和多肽的定量，获得满意结果。

查阅相关文献，未见任何分离检测地龙多肽的报道。本论文根据地龙化学成分鉴定及药理研究等相关文献，选取六种具有生物活性且有较强紫外吸收的地龙多肽（即Annectocin、PTP、VQ-5、OEP3121、F-1 和AQ-5）进行分离测定。因上述地龙多肽多数均为小分子多肽，极性较大，前期实验采用HPLC 无法同时分离多种地龙多肽。本实验发现采用毛细管区带电泳法可在10 min 内快速同时分离检测六种地龙多肽。但由于地龙多肽稳定性较差，文献报道提取上述地龙多肽需要采用地龙鲜品在低温环境下提取或采用活地龙电针刺激其产生体液[8,23]，由于实验条件限制，未能将该方法用于实际药材中对地龙多肽的测定。但将其用于人加标尿样的测定，回收率良好，表明该方法有望用于复杂样品体系中地龙多肽的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Beckman P/ACE MDQ 型毛细管电泳仪（Beckman Coulter公司，美国），配以二极管阵列检测器及32Karat软件；戴安UltiMate3000高效液相色谱仪（美国戴安公司）；弹性未涂层石英毛细管（75 µm × 60 cm，有效长度49.5 cm，永年县锐沣色谱器件有限公司），KQ-2200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），雷磁PHS-3C 型酸度计（上海仪电科学仪器有限公司），XS105电子分析天平（梅特勒-托利多国际股份有限公司）。

六 种 多 肽Annectocin（CFVRNCPYG-NH2）、PTP（GFRDGSADRISHGF-amide） 、VQ-5 （VSSVQ） 、OEP3121（ACSAG）、F-1（Ac-AMVSS）和 AQ-5（AMADQ）对照品均购自上海吉尔生化有限公司（纯度98%）；乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），乙酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），二水合磷酸二氢钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），十二水合磷酸氢二钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），乙腈（色谱纯，德国Merck 公司），甲酸（分析纯，西陇科学股份有限公司），硼酸（分析纯，西陇科学股份有限公司）、十水合四硼酸钠（分析纯，西陇科学股份有限公司），盐酸（分析纯，西陇科学股份有限公司），所有实验用水为Milli-Q超纯水。

尿液来源于实验室成年健康志愿者在未服用任何药物的前提下所取得的空白尿液。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取6 种地龙多肽标准品1 mg 至1 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度，即得，六种地龙多肽浓度均为1 mg·mL-1。

1.2.2 样品处理

将人尿样品过0.22 µm 的微孔滤膜，取续滤液。向人尿样品续滤液中加入对照品Annectocin、PTP、VQ-5、OEP3121、F-1、AQ-5，使这六种多肽的浓度均达到80 ug·mL-1。

1.2.3 电泳条件

新毛细管使用前分别用水，0.1 mol·L-1HCl 溶液，水，0.1 mol·L-1NaOH 溶液，水各冲洗20 min；旧毛细管使用前分别用水，0.1 mol·L-1NaOH 溶液，水，运行缓冲液各冲洗8 min。

未涂层毛细管：75 µm × 60 cm（有效长度为49.5 cm）；运行电压是20 kV，检测波长是215 nm，压力进样3.45 kPa×10 s，操作温度为25℃；每次进样前，需运行超纯水冲洗3 min，0.1 mol·L-1NaOH 溶液冲洗3 min，缓冲溶液冲洗3 min。

1.2.4 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（4.6 mm × 250 mm，5 µm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸（1:99）；检测波长：215 nm；流速：1 mL·min-1；进样量：10µL；柱温：25℃。

2 结果与讨论

2.1 分离方法的选择

分离检测多肽最常用的方法有高效液相色谱法和毛细管电泳法，首先对分离方法进行选择；在预实验中，先尝试使用高效液相色谱法，依次采用等度洗脱、一步梯度、多步梯度的洗脱方式，均不能使六种多肽同时全部出峰，且可出峰的多肽保留时间长，色谱峰拖尾严重，无法达到同时快速分离检测的要求，原因可能是六种小分子地龙多肽极性过大，保留过少，不适宜采用高效液相色谱进行分离。之后，尝试使用毛细管电泳对六种地龙多肽进行分离，在预实验中，采用毛细管区带电泳模式，六种多肽均可出峰，且分析时间短因此，选择毛细管电泳区带电泳模式对地龙多肽进行分离。

由于多肽均含有羰基基团，具有紫外吸收，因此选择二极管阵列检测器（PDA）对多肽进行检测分析，选择检测波长为215 nm。

2.2 缓冲液种类的优化

电泳缓冲液种类是样品组分能否得到完全分离的关键因素之一，缓冲体系不同，物质的迁移行为有很大差异。实验分别考察了硼砂-硼酸，磷酸二氢钠-硼砂，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，乙酸-乙酸铵及乙酸铵-氢氧化钠这几种缓冲液体系对六种地龙多肽迁移行为的影响，结果见图1。以乙酸铵-氢氧化钠溶液为缓冲液时，六种多肽能得到完全分离，且分析时间较短，同时峰面积和峰高较大，因此选择乙酸铵-氢氧化钠溶液为最佳缓冲液。

2.3 分离缓冲液pH值的优化

图1 缓冲液种类对分析物迁移时间的影响

缓冲液的pH 决定了各组分的解离程度，即影响其有效淌度，各组分因有效淌度不同而得到分离，因此，缓冲液的pH 是影响各组分分离效果的一大关键。实验考察了乙酸铵体系（pH值分别为2.0、4.0、6.0的乙酸-乙酸铵缓冲液和pH 值分别为8.0、10.0 乙酸铵-氢氧化钠缓冲液）在不同pH 值条件下六种地龙多肽的分离效果。结果表示，当pH 值为2.0 时，各多肽峰拖尾严重，且多肽5 及多肽6 在21 min 内未出峰。当pH值为4.0 时，各多肽峰无法完全分离，多肽1 和多肽2，多肽3 和多肽4 几乎完全重合，且拖尾严重。当pH 值为6.0时，多肽2和多肽3，多肽4和多肽5无法分离，且出峰时间较长。当pH 值为10.0 时，虽然各多肽出峰时间短，但多肽2 和多肽3 的峰叠加在一块，无法分离。综合考虑，选择缓冲液的最佳pH 值为8.0，结果见图2。

2.4 分离缓冲液浓度的优化

缓冲液的浓度直接影响了电泳介质的离子强度，改变Zeta 电势，从而影响到电渗流。缓冲液浓度越高，离子强度越强，Zeta电势越低，电渗流越小，样品的保留时间越长。同时，缓冲盐的浓度会影响电泳介质的电导，若电导大于样品溶液的电导会产生堆积效果，提高分析灵敏度。但缓冲液的浓度越高，电流越大，热效应越大，样品组分峰型展宽严重。缓冲液的浓度还会影响溶液的粘度、介电常数等来影响电渗，离子强度过高或过低都对提高分离效率不利。实验考察了不同浓度的乙酸铵浓度(固定NaOH 浓度为50 mmol·L-1)对六种地龙多肽分离效果的影响，见图3。当乙酸铵浓度为50 mmol·L-1时，多肽3 和多肽4，多肽5 和多肽6 无法完全分离，且多肽5 和多肽6 出峰时间较长。乙酸铵浓度为60-90 mmol·L-1，多肽均可在10 min 内得到完全分离，且峰面积、峰高和出峰时间差异不大，但随着乙酸铵的浓度增大，电流明显增加，焦耳热明显增多。因此，选择最佳的乙酸铵浓度为60 mmol·L-1。

图2 pH值对5种多肽的分离条件的影响

图3 不同缓冲液浓度的影响

图4 六种多肽的电泳谱图

2.5 分离电压的优化

实验考察了分离电压对分离效果的影响。当分离电压在20-25 kV 之间变化时，迁移时间虽有缩短但不显著，且随着电压增加，电流增大，焦耳热增多，基线稳定性下降，故综合考虑，选择分离电压为20 kV。

综上所述，优化最佳的实验条件：60 mmol·L-1乙酸铵-50 mmol·L-1氢氧化钠（pH = 8.0），运行电压是20 kV，检测波长是215 nm，压力进样3.45 kPa ×10 s，操作温度为25℃，最优条件下的电泳图见图4。

2.6 线性关系、精密度、检出限及定量限

在最佳实验条件下，分析测定了一系列不同浓度对照品溶液，以电泳谱图的峰面积（Y）与相应的化合物浓度X（µg·mL-1）进行线性回归，结果显示六种地龙多肽的峰面积和浓度呈现良好的线性关系，检测限（S/N=3）可低至为1.0µg·mL-1。将浓度为80µg·mL-1的六种地龙多肽混合溶液连续进样5 次，结果显示各分析物迁移时间的相对标准偏差（RSD）小于1.6%，峰面积的RSD小于9.5%，表明该方法精密度良好。线性关系、精密度、检测限及定量限的结果见表1。

2.7 稳定性实验

配制浓度为80 µg.mL-1的六种地龙多肽混合溶液，分别于0.5、1、1.5、2、2.5、3 h进样，记录Annectocin、PTP、VQ-5、OEP3121、F-1、AQ-5 六种多肽的峰面积，并计算其RSD。结果表明，Annectocin、PTP、VQ-5、OEP3121、F-1、AQ-5 六个组分的峰面积的RSD 分别为10%、5.3%、9.0%、9.6%、7.1%、8.8%，说明样品溶液在3 h内能相对稳定。

表1 6种多肽的线性方程、定量限、检出限及精密度

表2 人尿样中加标回收率的测定结果

图5 人空白尿样(A)及加标尿样(B)的电泳谱图

2.8 加标样品处理

按“1.2.2”项下样品处理方法对样品进行处理，然后直接进样所得图谱如图5，所测得的回收率结果见表2。由表2可知，除了F-1可能由于内源性物质的干扰，其他地龙多肽Annectocin、PTP、VQ-5、OEP3121、AQ-5的回收率良好。

3 结论

本文采用毛细管区带电泳法同时分离测定了地龙 的 六 种 多 肽，分 别 为Annectocin、PTP、VQ-5、OEP3121、F-1、AQ-5。实验对缓冲液的种类、pH 值、缓冲液浓度、分离电压进行了优化。在最优的条件下，六种地龙多肽可以在10 min 内实现基线分离。但地龙多肽稳定性较差，需要采用地龙鲜品在低温环境下方可提取，由于实验条件限制，未能将该方法用于实际药材中地龙多肽的测定。但将该方法用于人加标尿样的测定，回收率良好。本文所建立的方法简单快速，有望为地龙多肽的分离检测提供一个新手段。