兰花根石油醚部位化学成分研究＊

陈 俊，葛晓瑾，付 钰，陈随清＊＊

（1. 河南中医药大学药学院 郑州 450046；2. 河南省农业科学院经济作物研究所 郑州 450008）

兰花根为兰科植物建兰Cymbidium ensifolium (L.)Sw.、春兰Cymbidium goeringii (Rchb. f.) Rchb. f.、蕙兰Cymbidium faberi Rolfe 等的根。根据古籍《本草纲目》记载：“其气清香，生津止渴，润肌肉，治消渴胆瘅”[1]。兰科兰属植物通常为观赏花卉，但研究认为其根、叶、花、果及种子均有一定的药用价值，其中兰花根性辛、微寒，有清热利湿、活血止血、解毒杀虫之功效。有文献指出，兰花根可治疗肺结核、肺脓肿扭伤等，亦可用于接骨[2-3]。

现代民间医者有用兰花根配伍治疗疾病的经验及部分案例[4-5]，例如：兰花根配伍卷柏、野菊花，用以治疗鼻咽癌后遗症；兰花配伍白茅根、山豆根、蒲公英，用以治疗喉癌放疗后遗症；兰花配伍夏枯草、灵仙、半枝莲、白花蛇舌草，用以治疗食道癌放疗后患者；兰花根配伍茅根、冬瓜皮，用以治疗泌尿系统感染；兰花配伍美人蕉、徐长卿，治疗神经衰弱；新鲜建兰根，榨汁或水煎服用，用于治疗肺结核咯血，等等。但现有文献对兰花根化学成分的研究报导屈指可数[6]，对于兰花根药理活性的研究尚未见报导。

本实验采用阴干的蕙兰根为实验材料，95%乙醇加热回流提取得到兰花根提取物，经石油醚等萃取，对石油醚萃取部位采用多种柱色谱法进行分离纯化，并结合薄层检识结果及核磁数据进行结构鉴定；对两种提取方法所得总提物及个别单体化合物进行细胞活性研究，以MTT 法考察其对人肝癌细胞SMMC-7721 及小鼠乳腺癌细胞4T1 的增殖抑制作用，以脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞RAW264.7 为炎症模型，检测NO 释放浓度，以考察所得石油醚部位总成分及单体成分抗炎活性。对蕙兰根石油醚部位的化学成分及其体外细胞活性研究，为兰花根的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

本实验所用兰花根样品采自河南省南阳市桐柏县，经河南中医药大学陈随清教授鉴定，样品为兰科（Orchidaceae）兰 属（Cymbidium Sw.）植 物 蕙 兰（Cymbidium faberi Rolfe.）的干燥根[7]。

样品置于室内阴干后，干燥试样呈不规则弯曲或卷曲长圆柱状，直径约4 mm，表面呈浅棕色或黄棕色，具有不规则横纹及纵纹。质轻而脆，木部呈类白色或类白色，细长，直径约1 mm，质硬，皮部与木部几乎完全分离。

1.1.2 细胞材料

巨噬细胞RAW264.7、小鼠乳腺癌细胞4T1（购自上海中科院细胞库），人肝癌细胞SMMC-7721（武汉普诺赛生命科技有限公司）。

1.1.3 仪器与试剂

TRACE 1310/TSQ 8000 GC-MS联用仪（三重串联四级杆，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；超导核磁共振仪（DPX-400 型）（瑞士Bruker 公司）；质谱仪（LTQ-Orbitrap XL Hybrid 型）（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；1260 型半制备高效液相色谱仪（配有四元泵、在线脱气机、自动进样器、自动馏分收集器、UV 检测器和Chemstation 工作站，美国AgiLent 公司）；LC-52 型半制备高效液相色谱仪（配有双元泵，UV 检测器）；转蒸发仪（N-1000 型）（上海爱朗仪器有限公司）。

Thermo Fisher Scientific 371 型CO2恒温细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司），SW-CJ-2F 型超净工作台（广州市深华生物技术有限公司），GR60DF 型高压蒸汽灭菌锅（厦门致微仪器有限公司），BSA 124 S、BT 25 S 型分析天平（赛多利斯科技仪器有限公司），2 µL、10 µL、200 µL、1000 µL 移液枪（德国Eppendorf 艾本德公司），TD 5 型低速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司），Motic AE 2000 型倒置显微镜，BCD-315 TNGS 型低温冰箱（青岛海尔股份有限公司），VarioskanTMLUX 型全自动多功能酶标仪（美国赛默飞世尔公司），MX-S 型涡旋混合仪（大龙兴创实验仪器有限公司），血球计数板（上海市求精生化试剂仪器有限公司）。

薄层层析硅胶G、GF254（颗粒范围10-40µm），柱层析硅胶G（160-200 目、200-300 目）（购自青岛海洋化工厂），分析纯甲醇、正丁醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚等（购自天津市致远化学试剂有限公司，天津市富宇精细化工有限公司）。

RPMI-1640 培养基、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、脂多糖（LPS）、胰蛋白酶（0.25%EDTA）、青霉素-链霉素混合液（双抗）（以上均购自索莱宝生物科技有限公司），DMSO（上海麦克林生化试剂有限公司、美国Sigma 公司），四季青胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技有限公司），Corning DMEM 培养基（美国Corning 公司）、LONSERA 胎牛血清（FBS），萘乙二胺盐酸盐、磺胺、亚硝酸钠（上海麦克林生化试剂有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 单体化合物提取分离方法

取兰花根干燥药材5.6 kg，加以95%乙醇连续回流提取3次（每次2 h），合并提取液，减压抽滤，滤去药渣。滤液经真空减压浓缩，至无醇味浸膏状，得兰花根95%乙醇总提物浸膏869.2 g。浓缩浸膏加以适量蒸馏水混悬，使用有机试剂（石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇），依试剂极性由低到高，进行多次重复萃取，单次萃取液料比为1∶1，同一溶剂反复萃取5次以上（含5 次），至萃取液基本无色时更换为下一溶剂。将萃取所得石油醚部位进行减压浓缩，挥至干膏，共得石油醚部位萃取物（79.1 g）。

使用100 目硅胶，对石油醚部位萃取物拌样、装柱，以石油醚：氯仿体系梯度（100∶1，80∶1，50∶1，20∶1，10∶1，3∶1）顺次洗脱，收集流出液。根据GF254 薄层板硅胶板检识结果，对具有相同薄层行为的流出液合并，反复利用吸附色谱法（硅胶柱层析）、分配色谱法（凝胶）（二氯甲烷：甲醇）以及重结晶的方法，对该部分成分进行分离纯化。对单体化合物进行薄层检识及13C-NMR，1H-NMR等分析，确定结构。

1.2.2 细胞活性研究方法

（1）细胞培养

巨噬细胞RAW 264.7、人肝癌细胞SMMC-7721、小鼠乳腺癌细胞4T1 均为贴壁生长细胞。细胞复苏后，传代培养3代以上，待细胞状态稳定，以适量浓度接种于培养皿中，根据细胞类型及生长要求不同，分别选择加入含10%胎牛血清的DMEM 或RPMI-1640 完全培养基。将细胞培养皿置于37℃恒温、5%CO2稳定及湿度饱和的培养箱中培养，根据传代培养观察细胞生长状态，取对数生长期细胞进行实验。

（2）细胞抑制增殖实验（MTT法）

取对数生长期细胞，以细胞浓度为2×105mL-1，每孔100 µL 接种于96 孔培养板中，培养12 h。取出培养板，吸出上清液弃去，设正常组与给药组（石油醚萃取物总部位给药浓度梯度为200µg·mL-1、100µg·mL-1、50 µg·mL-1、25 µg·mL-1、12.5 µg·mL-1、6.25 µg·mL-1，单体化合物给药浓度梯度为100 µmol·L-1、50 µmol·L-1、25 µmol·L-1、12.5 µmol·L-1、6.25 µmol·L-1、3.125µmol·L-1），每个浓度设3 个复孔。给药组各孔加入相应浓度药物200 µL，正常组加入不完全培养基200µL，培养24 h。吸出上清液弃去，每孔加入100µL 不完全培养基及20µL MTT（5mg·mL-1），孵育4 h。终止培养，吸取孔内上清，弃去。每孔加入150µL DMSO，摇床振荡15 min，酶标仪570 nm 测各孔OD 值，记录结果。

（3）NO浓度标曲测定

称取亚硝酸钠，按比例加入蒸馏水配制成100 mmol·L-1亚硝酸钠溶液，以100 mmol·L-1亚硝酸钠为母液，稀释为100 µmol·L-1、50 µmol·L-1、25 µmol·L-1、12.5 µmol·L-1、6.25 µmol·L-1、3.125 µmol·L-1、1.5625µmol·L-1、0.7813 µmol·L-1、0.3906 µmol·L-1、0.1953µmol·L-1、0.0977 µmol·L-1、0.0488 µmol·L-1、0.0224µmol·L-1，共13 个不同浓度点。酶标仪540 nm 测各孔OD值，绘制标准曲线。

（4）抗炎活性测定（NO浓度）

取巨噬细胞RAW 264.7，以细胞浓度为1×106mL-1，每孔100µL接种于96孔培养板中，培养12 h。取出培养板，吸出上清液弃去，设立正常组，模型对照组（LPS，浓度1µg·mL-1，），阳性对照组（地塞米松，浓度10 µmol·L-1），给药组（依MTT 结果设定浓度，药物以含1 µg·mL-1LPS 的不完全培养基稀释），每个浓度3个复孔，各孔加入相应浓度药物200 µL，培养24 h。终止培养，取各孔上清100µL，加入Griess 试剂（试剂A[1%磺胺磷酸溶液（5%）：试剂B（0.1%的萘基乙烯基二胺）]1：1）100 µL，反应15 分钟，酶标仪540 nm 测各孔吸光值，代入标曲计算NO浓度。

（5）数据处理

检测及计算所得数据导入GraphPad Prism 7.00 软件，绘制柱状图，并以空白组或模型组作对照。对数据结果进行t检验，根据P值衡量各药物作用显著性。

2 结果与分析

2.1 提取分离法结果与分析

化合物1（25 mg）白色针晶，易溶解于三氯甲烷等。1%茴香醛-浓硫酸显紫红色，提示可能为甾体类化合物。1H-NMR（500 MHz，in DMSO）数据显示，不饱和区δ 5.33（1H，s）为烯烃氢信号，δ 3.97（1H，d，J=2.3 Hz），δ 3.93（1H，m）为连氧叔碳氢信号。13C-NMR（125 MHz，in DMSO）谱显示，不饱和区仅两条谱线，即δ：（145.2，128.8），对应两个烯烃碳信号；δ：（72.2，66.1）对应两个连氧季碳氢信号。其余碳信号为δ：[55.6，55.5，54.1，45.1，42.0，36.8，36.3，35.5，33.3，29.9，28.9，28.7，27.7，26.4，23.8，22.6，20.9，20.5，19.7，18.9，18.6，11.8（末端CH3），11.7（末端CH3）]，以上数据与文献[8]中NMR 数据进行对比，本实验碳谱中δ：[39.7（C-8），39.1（C-11）]两处碳信号与溶剂峰重叠，其余信号基本一致，故确定该化合物为豆甾-4-烯-3β，6β-二醇。

化合物2（125 mg）白色片状结晶，溶于二氯己烷、三氯甲烷、丙酮等有机溶剂。GF254 硅胶薄层层析检识，碘蒸显棕黄色斑点，1%茴香醛浓硫酸显色呈紫红色斑点。1H-NMR（500 MHz，in CDCL3）谱中，较明显的质子氢信号化学位移值为δ：[5.33（1H，d，J = 4.0 Hz），3.50（1H，m），2.26（2H，m），1.98（2H，m），1.51（br，(CH2)n），1.09（br.s，(CH2)n），0.66（3H，s），0.78（3H，d，J = 8.4 Hz），0.81（3H，d，J = 4.1 Hz），0.84（3H，d，J =8.8 Hz）]。13C-NMR（125 MHz，in CDCL3）谱图中共显示出28 条碳谱谱线，即表明该化合物结构中共有28种碳原子，化学位移值为δ：（11.8，12.0，18.8，19.0，19.4，19.8，21.1，23.1，24.3，26.1，28.2，29.1，31.7，31.9，33.9，36.1，36.5，37.2，39.8，42.3，42.3，45.8，50.1，56.0，56.8，71.8，121.7，140.7），其中δ 31.9 处谱线积分值为其余谱线二倍，故推断该化合物共有29 个碳原子，δ 121.7，δ 140.7 两处为烯碳特征信号峰，证明该化合物结构中含有不饱和双键结构。查阅文献[9-10]NMR 数据，进行对比，确定该化合物为β-谷甾醇。

图1 化合物1-5结构图

化合物3（20 mg）白色结晶，易溶解于二氯甲烷、三氯甲烷等低极性有机溶剂。1%茴香醛-浓硫酸显色，加热后呈紫红色斑点，提示可能为甾体类化合物。：1H-NMR（500 MHz，in CDCL3）谱中，氢信号主要集中于高场区，含有较多非连氧脂肪氢信号，在低场区δ 5.35（1H，d，J=3.8 Hz）处可见到烯烃质子信号，另含一组δ 4.60（1H，m）处可见的连氧烷烃氢信号，高场区δ：[1.00（3H，s），0.66（3H，s）]为与季碳相连的甲基氢信号，δ 1.27（br.s，(CH2)n）显示信号重叠的多个—CH2—结构。13C-NMR（125 MHz，in CDCL3）谱中，不饱和区δ 173.3 为羰基碳信号，δ 139.7 和δ 122.5 处对应烯碳信号，其余信号中δ 73.6 为连氧叔碳信号，δ：（11.8，11.9，14.1，18.8，19.0，19.3，19.8）为末端甲基碳信号，δ：（21.0，22.7，23.1，24.3，25.1，26.1，27.8，28.2，29.1，29.1，29.3，29.4，29.5，29.6，29.7，29.7，29.7 × 3，31.9，31.9，31.9，33.9，34.7，36.1，36.6，37.0，38.2，39.7，42.3，45.8，50.0，56.0，56.7）为饱和脂肪碳信号。以上数据与文献[11]中NMR 数据对照，确定该化合物为β-谷甾醇棕榈酸酯。

化合物4（16 mg）无色油状，易溶于三氯甲烷等有机溶剂。1H-NMR（500 MHz，in MeOD）数据显示6 组氢信号，其中2 组不饱和区氢信号δ：[7.71（1H，d，J =9.0 Hz），7.60（1H，d，J = 9.0 Hz）]为邻位芳氢信号，δ 4.28（2H，t，J = 6.6 Hz）为连氧亚甲基氢信号，δ：[1.71（2H，m），1.45（2H，m）]为亚甲基氢信号，δ 0.94（3H，t，J = 7.5 Hz）为甲基氢信号。13C-NMR（125 MHz，in MeOD）显示8 组碳信号，其中4 组不饱和区碳信号分别为δ：（169.3，133.6，132.3，129.9），δ 169.3 处为羰基碳信号，其余3 组为芳碳信号；饱和区δ 65.5 为连氧碳信号，δ 30.5，δ 19.1，δ 13.7（末端CH3）为饱和脂肪链碳信号。结合以上信息，判断该结构中含一个邻位二取代苯环，且两个取代基结构相同。以上数据与文献[12]中谱数据对比，确定该化合物为邻苯二甲酸二丁酯。

化合物5（50 mg）白色片状结晶，溶解于甲醇等有机溶液。1%茴香醛-浓硫酸显色，加热后呈紫红色斑点；莫立许反应呈阳性。1H-NMR（500 MHz，in DMSO）谱中，δ 5.32（1H，d，J = 4.9 Hz）为烯氢信号，δ 4.84-4.88（3H，br.m）为3 个—OH 活泼氢信号，δ 4.21（1H，d，J = 7.8 Hz）为β-D-葡萄糖端基氢信号。13CNMR（125 MHz，in DMSO）谱中，低场区δ 140.4 和δ 121.2 处为烯碳信号，δ 100.8 为氧苷端基碳信号，其余C谱数据为δ：（11.7，11.8，18.6，18.9，19.1，19.7）为末端甲基碳信号，δ：（20.6，22.6，23.8，25.4，27.8，28.7，29.2，

31.4 ，31.4，33.3，35.5，36.2，36.8，38.3，41.8，45.1，49.6，55.4，56.2）为饱和脂肪烃碳信号，δ 61.1 为连氧仲碳信号，δ：（70.1，73.5，76.8×2，76.9）为5 个连氧叔碳信号。结合HMBC谱及HSQC谱，查阅文献[13]中NMR数据，进行对比，确定该结构为胡萝卜苷。

化合物结构如图1所示。

2.2 细胞活性试验结果与分析

2.2.1 MTT结果

兰花根提取物石油醚萃取部位、豆甾-4-烯-3β，6β-二醇对巨噬细胞RAW 264.7 无明显细胞增殖抑制作用，细胞存活率均大于90%。作用于人肝癌细胞SMMC-7721 后，石油醚部位给药浓度为25µg·mL-1时有极显著增殖抑制作用，豆甾-4-烯-3β，6β-二醇给药浓度为25µmol·L-1时有显著增殖抑制作用，结果见图2。作用于小鼠乳腺癌细胞4T1 后，石油醚部位在25µg·mL-1仍有极显著增殖抑制作用，豆甾-4-烯-3β，6β-二醇给药浓度为25µmol·L-1时有显著增殖抑制作用，结果见图3。（图表绘制使用GraphPad Prism 7.00软件）。

图2 提取物及单体对肝癌细胞增殖抑制活性

图3 提取物及单体对小鼠乳腺癌细胞增殖抑制活性

图4 NO浓度标准曲线

2.2.2 抗炎活性（NO释放抑制）结果

兰花根提取物石油醚总部位对脂多糖（LPS）所致巨噬细胞炎症模型，有较强NO 释放抑制活性，而豆甾-4-烯-3β，6β-二醇，NO 释放抑制活性不明显。NO标准曲线如图4，给药结果见图5。

3 讨论

兰花作为我国著名观赏花卉为高等植物，其生长进化级别较高，成分比较复杂。石油醚萃取部位在兰花根95%乙醇总提物中占比为9.10%。该部分化学成分极性较小且较为集中，分离纯化有一定难度。本实验主要分离得到5个单体成分，分别为：β-谷甾醇棕榈酸酯（20 mg）、邻苯二甲酸二丁酯（16 mg）、豆甾-4-烯-3β，6β-二醇（25 mg）、β-谷甾醇（125 mg）、胡萝卜苷（50 mg），多为药用植物中常见化学成分，其中豆甾-4-烯-3β，6β-二醇为兰科植物首次分离得到。

本实验体外活性研究结果显示，石油醚部位及单体豆甾-4-烯-3β，6β-二醇，均在不同程度上具有抗炎及抗肿瘤（人肝癌SMMC-7721、小鼠乳腺癌4T1）活性，且石油醚部位活性优于豆甾-4-烯-3β，6β-二醇。

图5 提取物及单体化合物抗炎活性

有文献报导显示：β-谷甾醇对H22 荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用[14]，对肺癌[15]、肝癌[16]、乳腺癌[17]、胃癌[18]、胰腺癌[19-20]和宫颈癌[21-22]等均有抑制增殖或诱导凋亡的作用，并有抗炎，降血脂等药理活性，对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和变形杆菌四种细菌均有一定的抑制作用，且具有一定的抗氧化效果[23-24]；胡萝卜苷对HeLa 和HepG-2 细胞具有一定的细胞毒性作用[25-27]，对大肠杆菌有轻微的抑制活性，具有一定的抗氧化、降低血糖[28]作用；邻苯二甲酸二丁酯的生物活性主要体现在对植物病菌的抑制作用，例如对茄子根际黄萎菌具的抑制作用及对水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌病原菌都有一定的杀菌活性[29]，但作用于人体，往往体现出一定的雌激素作用[30]，促迸卵巢细胞凋亡，抑制卵巢的抗氧化能力[31]，促进雌激素依赖性乳腺癌MCF-7 细胞的增殖[32]；β-谷甾醇棕榈酸酯未显示出对人肝癌细胞BEL-7402 有细胞毒活性[33]。兰科药用植物中，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎作用的独蒜兰、贝母兰、带叶卷瓣兰、杜鹃兰中均含有β-谷甾醇、胡萝卜苷等甾体类成分[34-37]。

结合前人研究及本实验结果，我们认为兰花根基原种类较多，但目前进行分离研究的仅限于蕙兰根，且所得的化合物种类较少；兰花根（蕙兰根）石油醚部位具有明显的抗炎及抗肿瘤活性，但兰花根的具体药效成分及作用机制尚不明确，因此具有进一步研究和开发利用的药用价值；加之兰花观赏性高，根系发达，在大规模人工栽培、繁育和移植过程中，大量根及须根被废弃，因此，对兰花根的开发利用也有不容忽视的经济价值。