四磨汤中4种槟榔生物碱的HPLC测定＊

杨雅蛟，孔维军，孙 兰，孙桂波，周立东，孙晓波

（中国医学科学院药用植物研究所中草药物质基础与资源利用教育部重点实验 北京 100193）

四磨汤最早记载于《重订严氏济生方》，由槟榔、木香、枳壳和乌药组成，主要用于治疗七情伤感、上气喘息、胸膈满闷、不思饮食等症[1]，临床治疗胃肠道动力不足、手术后胃肠功能障碍及胃瘫[2]、婴幼儿乳食内滞证和中老年气滞食积症[3]。有文献记载四磨汤口服液用于治疗新生儿黄疸、功能性消化不良、胃食管返流等症状[4-7]。作为四磨汤的主要组成药味，槟榔是棕榈科植物槟榔Areca catechu L.的干燥成熟种子。春末至秋初采收成熟果实，水煮后干燥，除去果皮，取出种子，干燥即得。苦，辛，温，归胃、大肠经，有杀虫、消积、行气、利水和截疟的功效[8]。传统使用时，无毒性记载。海南等地有咀嚼鲜槟榔果实的习惯，但是长期咀嚼易引发口腔癌症。有研究认为槟榔碱有潜在致癌活性[9]。2003 年，槟榔被世界卫生组织的国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）认定为一级致癌物。中医临床上长期使用含槟榔的复方制剂，但鲜见引起毒副作用的报道。

槟榔碱、新弗林、去甲异尔定、柚皮苷为四磨汤的主要活性成分[10]，而国家药品标准只对四磨汤中柚皮苷进行了HPLC 测定[11]，并未涉及其它成分。四磨汤中槟榔生物碱类成分是其潜在的毒性风险物质。槟榔碱是槟榔含量最高的生物碱，其次是槟榔次碱、去甲基槟榔碱、去甲基槟榔次碱。为此，本文建立了灵敏准确的HPLC 方法，同时测定四磨汤中4 种槟榔生物碱的含量，为其质量控制提供技术支撑和数据支持。

1 仪器与试剂

Waters 高效液相色谱系统，包括Waters 996 型紫外检测器、Waters 600型四元泵、Waters 2695型自动进样器和Waters Empower 2 色谱工作站（美国Waters 公司）；JM-A30001 型电子天平（余姚纪铭称重校验设备有限公司），KQ5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），PB-10 型pH 计（德国Sartorius），N-1100型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），DLSB-5/20型低温冷却循环（郑州长城科工贸有限公司），RCT 型磁力搅拌器（IKA），AF-7A 型手提紫外检测灯（上海宝山顾村电光仪器厂），GP110-230 型无油隔膜泵（美国New Ipswich）。

氢溴酸槟榔碱（Ark，批号WG0114638-84239），1-氯乙基氯甲酸酯（Alfa，批号5002V13P），无水乙醚（分析纯，北京化工厂，批号20160118），无水碳酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号20170906），二氯甲烷（分析纯，北京化工厂，批号20160902），1,2-二氯乙烷（分析纯，北京市通广精细化工公司，批号20171215），石油醚（分析纯，北京化工厂，批号20170216），乙酸乙酯（分析纯，北京化工厂，批号20171208），乙腈（色谱纯，Fisher 公司，批号106246），哇哈哈纯净水（批号201707173103GH），磷酸（HPLC级，Dikma 公司，批号5492278），三乙胺（HPLC 级，Dikma 公司，批号4048217），四磨汤样品（湖南汉森制药股份有限公司，批号161201），槟榔样品（湖南汉森制药股份有限公司，批号161203），去甲基槟榔次碱（Sigma，批号040M4741V，纯度99.4%），盐酸槟榔次碱（Alfa Aesar，批号10114762，纯度99.8%），盐酸去甲基槟榔碱（自制，纯度99.1%），氢溴酸槟榔碱（美国ChromaDex，批号00001691-73F，纯度99.7%）。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：阳离子Agela Venusil SCX（T）（4.6 mm ×250 mm,5µm）柱；流动相：乙腈:0.5%磷酸（三乙胺调pH 至2.40）= 45:55，流速：1.0 mL·min-1，检测波长：215 nm，柱温：25℃，进样量：10.0µL（供试品），5.0µL（对照品）。

2.2 供试样品溶液的制备

湖南汉森制药股份有限公司提供含槟榔、乌药、枳壳、木香的四磨汤样品和按照公司方法制备的仅含槟榔的槟榔样品。

分别精密量取0.5 mL 样品溶液于10 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，用0.45 µm 微孔滤膜过滤，即得各供试品，待用。

2.3 对照品溶液的制备

2.3.1 盐酸去甲基槟榔碱的实验室制备

称取1.023 g 氢溴酸槟榔碱置于锥形瓶中，加5 mL水，用饱和碳酸钠调至pH=13.0，加入50 mL 无水乙醚萃取3次，合并乙醚液，旋蒸至干，即得槟榔碱（413 mg）。

称取140 mg 槟榔碱，置50 mL 锥形瓶中，加3 mL二氯甲烷、0.12 mL 1-氯乙基氯甲酸酯和5 mL 1,2-二氯乙烷于0℃搅拌15 min，然后于100℃加热回流6 h至反应完全[薄层色谱TLC 监测反应进度，以石油醚:乙酸乙酯（2∶3）为展开剂，高锰酸钾显色]，蒸干反应液，得黄色油状物（180 mg），用少量石油醚溶解，以样品与硅胶1∶30 比例装柱，以乙酸乙酯:石油醚（3∶2）洗脱，收集产物并蒸干（150 mg），加5 mL 甲醇110℃回流6 h 至反应完全[TLC 监测反应进度，以石油醚:乙酸乙酯（2∶3）为展开剂，高锰酸钾显色]，蒸干得到终产物即为盐酸去甲基槟榔碱（101 mg）。氢溴酸槟榔碱与盐酸去甲基槟榔碱的核磁共振氢谱（hydrogen nuclear magnetic resonance，HNMR）谱图，见图1。

从图1 可以看出，与氢溴酸槟榔碱的HNMR 图对比，盐酸去甲基槟榔碱的HNMR 图中缺少一个甲基，多一个氨基氢，与文献报道的盐酸去甲基槟榔碱数据相符合[12]，表明盐酸去甲基槟榔碱已成功制备，用高效液相归一法测得纯度为99.1%。

2.3.2 混合对照品溶液的制备

精密称取15.0 mg 去甲基槟榔次碱、25.0 mg 盐酸槟榔次碱、10.0 mg 盐酸去甲基槟榔碱和25.0 mg氢溴酸槟榔碱对照品至25 mL 容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，制成对照品储备液。再精密量取2 mL 对照品储备液置于10 mL 容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得含119.28 µg·mL-1去甲基槟榔次碱、199.60µg·mL-1盐酸槟榔次碱、79.28µg·mL-1盐酸去甲基槟榔碱和199.40µg·mL-1氢溴酸槟榔碱的混合对照品溶液。

3 实验结果

3.1 方法学考察

3.1.1 线性关系考察

图1 氢溴酸槟榔碱(A)与盐酸去甲基槟榔碱(B)的HNMR谱图对比

分别精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6 mL混合对照品溶液至2 mL 容量瓶中，用色谱甲醇稀释至刻度，制成6 个不同浓度的混合标准品溶液。用0.45µm 微孔滤膜过滤，按上述色谱条件进样分析，以峰面积（Y）对进样量（X）进行回归计算，得回归方程分别为：去甲基槟榔次碱Y=3.83×106X-4.68×104（R2=0.999），LOD为0.16 µg·mL-1，定 量 限（limit of quantitation，LOQ）为0.54µg·mL-1；盐酸槟榔次碱Y=3.36×106X+1.17×104（R2=0.999），LOD 为0.12µg·mL-1，LOQ 为0.38µg·mL-1；盐酸去甲基槟榔碱Y = 4.20 × 106X + 2.87 × 104（R2=0.999），LOD 为0.01 µg·mL-1，LOQ 为0.03 µg·mL-1；氢溴酸槟榔碱Y = 2.47 × 106X - 8.71 × 104（R2= 0.999），LOD 为0.47 µg·mL-1，LOQ 为1.56 µg·mL-1。结果 表明，去甲基槟榔次碱、盐酸槟榔次碱、盐酸去甲基槟榔碱和氢溴酸槟榔碱分别在11.94-95.42、19.96-159.68、7.928-63.424、19.94-159.52 µg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

表1 4种生物碱的加样回收率考察（n = 9）

3.1.2 精密度考察

取“2.3.2”的对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6 次，测得去甲基槟榔次碱、盐酸槟榔次碱、盐酸去甲基槟榔碱和氢溴酸槟榔碱含量的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）（n = 6）分别为0.6%、0.6%、0.8%和0.7%，保留时间的RSD（n = 6）分别为0.8%、0.5%、1.0%和0.9%，表明仪器精密度良好。

3.1.3 重复性考察

按“2.2”制备6 份供试品溶液，按上述色谱条件进行分析，测得四磨汤样品中去甲基槟榔次碱、盐酸槟榔次碱、盐酸去甲基槟榔碱和氢溴酸槟榔碱含量的RSD（n = 6）分别为0.8%、0.9%、1.0%和0.8%，保留时间的RSD（n = 6）分别为1.1%、0.5%、0.8%和0.8%，表明方法重复性良好。

3.1.4 稳定性考察

取同一份供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、24 h进样测定，测得四磨汤样品中去甲基槟榔次碱、盐酸槟榔次碱、盐酸去甲基槟榔碱和氢溴酸槟榔碱含量的RSD（n = 6）分别为1.1%、0.8%、1.2%和0.9%，保留时间的RSD（n = 6）分别为0.8%、0.6%、1.0%和0.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.1.5 加样回收率考察

精密吸取9 份已知4 种生物碱含量的四磨汤样品，每份0.5 mL，置于10 mL 容量瓶中，每3 份为一组，每组中按样品溶液中相应成分含量的80%、100%、120%加入对照品溶液，按“2.2”制备供试品试液，按上述色谱条件进行分析。结果表明，四磨汤样品中去甲基槟榔次碱、盐酸槟榔次碱、盐酸去甲基槟榔碱和氢溴酸槟榔碱的平均加样回收率分别是101.04%、101.263%、103.45% 和98.43%，RSD（n = 9）分别为2.0%、1.1%、1.8%和0.9%。

3.2 样品测定

将制备的四磨汤和槟榔样品溶液按上述色谱条件进行分析，测得的4种生物碱对照品及四磨汤和槟榔样品的HPLC图谱见图2。结果表明，在优化的色谱条件下，4个成分得到较好的分离，峰形较好，满足检测需求。

槟榔样品只含有槟榔次碱、槟榔碱、去甲基槟榔碱和去甲基槟榔次碱等成分，而实际购买到的对照品为槟榔次碱、槟榔碱、去甲基槟榔碱的盐酸盐或氢溴酸盐，因此，实验中以177.63 mg 盐酸槟榔次碱相当于141.18 mg 槟榔次碱、236.25 mg 氢溴酸槟榔碱相当于155.19 mg 槟榔碱、177.64 mg 盐酸去甲基槟榔碱相当于141.19 mg 去甲基槟榔碱进行换算后，计算四磨汤和槟榔液样品中各生物碱成分的含量，见表2。

含量测定结果表明，四磨汤中去甲基槟榔次碱、槟榔次碱、去甲基槟榔碱和槟榔碱的平均含量分别为0.039 3、0.059 0、0.002 5、0.088 8 mg·mL-1；槟榔样品中去甲基槟榔次碱、槟榔次碱、去甲基槟榔碱和槟榔碱的平均含量为0.081 5、0.070 6、0.009 4、0.070 6 mg·mL-1。6份四磨汤样品中去甲基槟榔次碱和槟榔次碱含量波动比较大，6 份槟榔样品中槟榔次碱和去甲基槟榔碱的含量波动比较大，可能与样品中槟榔药材的采集地和采集时间等因素有关。此外，槟榔样品中的槟榔碱含量低于四磨汤样品，而槟榔样品中去甲基槟榔次碱、槟榔次碱和去甲基槟榔碱的含量均高于四磨汤样品，这可能与生物碱成分本身的性质、加工和样品制备环节对成分的影响有关。

图2 四磨汤（A）、槟榔样品（B）及对照品溶液（C）的HPLC图谱

槟榔和四磨汤样品中槟榔碱的含量均符合《中国人民共和国药典》（2015版）的规定（不得低于0.2%）[8]，但是未有去甲基槟榔次碱、槟榔次碱和去甲基槟榔碱的含量规定和要求。

4 讨论

4.1 色谱条件的优化

4.1.1 色谱柱的选择

4 种槟榔生物碱属于小分子化合物，极性很强，在常规反相色谱柱上的保留较弱，色谱柱的选择对4 个化合物的分离和准确测定至关重要。本研究中，我们比较了klomasil 100-5 C18（4.6 mm × 250 mm, 5 µm）柱、Tnature C18（4.6 mm × 250 mm, 5 µm）柱、Lichocart C18（4.6×250 mm,5µm）柱、Agilent Ertend-C18（4.6 mm×250 mm, 5 µm）柱 和Agela Venusil SCX（T）（4.6 mm ×250 mm,5µm）柱等不同类型色谱柱的分离效果。结果发现，阳离子Agela Venusil SCX（T）（4.6 mm×250 mm,5µm）色谱柱对4 个生物碱成分的分离效果和峰形均较好。

表2 样品中4种生物碱含量(mg·mL-1)测定结果

4.1.2 流动相pH值的影响

4 种槟榔生物碱色谱峰分离度受基质溶液pH 的影响较大，去甲基槟榔碱在碱性条件下会水解成去甲基槟榔次碱，因此流动相应选用酸性条件。实验中发现，流动相pH 值为1.90-3.00 时，4 个化合物的分离度较好，且pH 值越小，分离度越高，但同时对色谱柱造成损害，最终选定流动相pH为2.40。

4.1.3 流动相比例的选择

流动相的组成及比例关系也会影响4个生物碱化合物的分离效果。实验中，我们尝试并比较了乙腈:0.5%磷酸（三乙胺调pH=2.40）=50∶50、乙腈:0.5%磷酸（三乙胺调pH = 2.40）= 55∶45、乙腈:0.5%磷酸（三乙胺调pH = 2.40）= 45∶55 三个流动相组成的分离效果。结果发现，以乙腈:0.5%磷酸（三乙胺调pH =2.40）= 50∶50 为流动相时，去甲基槟榔次碱和槟榔次碱未能得到分离；以乙腈:0.5%磷酸（三乙胺调pH =2.40）=55∶45 为流动相时，去甲基槟榔次碱和槟榔次碱不能完全分离；以乙腈:0.5%磷酸（三乙胺调pH =2.40）=45∶55 为流动相时，去甲基槟榔次碱和槟榔次碱能得到较好的分离，因此以乙腈:0.5%磷酸（三乙胺调pH=2.40）=45∶55 为流动相时，4 个化合物均能得到较好的分离和较高的灵敏度。

4.2 方法优势和展望

由于盐酸去甲基槟榔碱对照品在市面上较难买到，实验中我们根据文献操作制备了盐酸去甲基槟榔碱，纯度为99.1%，能达到检测的要求。

优化的HPLC-DAD 方法能实现4 种生物碱的高效分离，且线性范围宽、分析速度快、精密度高和稳定性好，不仅可用于四磨汤中生物碱成分的含量测定，还可作为槟榔及其他含槟榔复方的相关生物碱成分含量测定的参考。

本实验通过方法学对4种槟榔生物碱进行了含量测定，在槟榔安全性评价中，研究最多的是槟榔碱，而槟榔次碱、去甲基槟榔碱和去甲基槟榔次碱的毒性并未有报道。周绪正等[13]研究发现，槟榔碱对小鼠口服最小致死量为370 mg·kg-1，最大耐受量为70 mg·kg-1，属于中低毒范畴。本实验测得汉森四磨汤口服液中槟榔碱平均含量在0.088 8 mg·mL-1，成人用量为每次20 mL，每日3次，每日槟榔碱摄入量约为5.328 mg，成年人的体重按50 kg 计算，槟榔碱摄入含量为0.047 16 mg·kg-1，比最小致死量低很多。因此，汉森四磨汤口服液槟榔含量达到安全指标，但出于安全考虑，不建议长期服用。