斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)病毒性神经坏死病毒的纯化分析及检测方法建立

葛 辉，吴丽云，周 宸，黄种持，吴建绍，郑乐云，林 琪，杨求华，吴水清，王艺磊，林克冰*

(1.福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013；2.集美大学水产学院，农业部东海海水健康养殖重点实验室，福建 厦门 361021)

石斑鱼(Epinephelussp.)隶属鲈形目(Perciformes)、鱼旨科(Serranidae)，广泛分布于热带和亚热带沿岸及岛礁海域，是世界上最重要的海洋经济鱼类之一。目前，我国已有记录的石斑鱼共45种，主要分布于东南沿海和南海[1]。石斑鱼作为我国重要的海水经济鱼类，其养殖产业已进入规模化养殖阶段，但是随着养殖密度不断增加和养殖环境的恶化，石斑鱼的各种病害暴发频率也随着养殖规模的扩大呈现迅速上升的势头，极大地制约了我国石斑鱼养殖业的健康持续发展[2-5]。其中由病毒感染引起的传染性疾病在鱼类病害中最难预防和治疗，国内已报道的能引起养殖石斑鱼患病的主要有诺达病毒科(Nodaviridae)和虹彩病毒科(Iridoviridae)[6-9]。

神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)，属于诺达病毒科(Nodaviridae)，β诺达病毒属(Betanodavirus)，病原体为二十面体、无囊膜、直径25～30 nm的RNA病毒[10-11]。NNV基因组由两条单链正RNAs组成，分别为RNA1和RNA2，其中RNA1的功能为RNA-dependent RNA polymerase (RdRp)，RNA2则可以转录翻译出病毒的外壳蛋白[12-14]。根据RNA2核酸序列同源性分析，将β型诺达病毒分成红鳍东方鲀神经坏死病毒(Tiger puffer nervous necrosis virus，TPNNV)、拟鲹神经坏死病毒(Striped jack nervous necrosis virus，SJNNV)、条斑星鲽神经坏死病毒(Barfin flounder nervous necrosis virus，BFNNV)和赤点石斑鱼神经坏死病毒(Redspotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)4个基因型[14]。由NNV引起的病毒性神经坏死病，也称鱼类脑炎病毒(Fish encepha litis virus，FEV)、病毒性脑病和视网膜病(Viral encephalopathy and retinopathy，VER)，是一种世界范围内流行的海水鱼类病毒病。至今已有报告的受该病危害的鱼类包括海水和淡水鱼类、温水性和冷水性鱼类：鳗鲡目(Anguilliformes)、鲈形目(Perciformes)、鲽形目(Pleuronectiformes)、鲀形目(Tetraodontiformes)、鳕形目(Gadiformes)，感染的种类包括5个目，涉及16个科，多达40余种，各种石斑鱼均可感染此病[15]。而主要发生在海水鱼类种苗生产阶段，鱼苗死亡率高达90%以上，给海水鱼类养殖业的发展带来严重的危害[16]。NNV引起的鱼类传染性疾病危害性广，致病性强，给养殖业造成了严重的经济损失。

本研究从患病斜带石斑鱼中分离得到NNV，并在克隆出NNV核酸序列的基础上，建立了石斑鱼神经坏死病毒RT-PCR灵敏度分析、病毒感染细胞实验，以期为今后在石斑鱼养殖产业中进行病毒检测提供技术支持，同时为石斑鱼苗种培育生产中神经坏死病毒病的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验鱼

发病斜带石斑鱼采自于小嶝水产科技有限公司水产养殖场的发病现场，取回实验室后-80℃保存。

1.1.2 试剂

RNA提取试剂盒和2×Taq Plus PCR MasterMix购自天根生化科技(北京)有限公司；反转录试剂盒购自全式金生物技术有限公司；pUC-19载体购自TaKaRa公司；DL 10 000 DNA标准物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物合成和DNA测序委托英潍捷基(上海)贸易有限公司完成；柱式DNA胶回收试剂盒和柱式质粒DNA提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；核酸染料GV-Ι(Gold ViewTM)为赛百盛基因技术有限公司产品；其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 病毒外壳蛋白克隆、序列比对和系统发育分析

1.2.1 病毒核酸抽提

取发病的斜带石斑鱼的脑、眼部组织，剪碎后，参照天根RNA提取说明书提取总RNA，-80℃保存备用。

1.2.2 引物设计

根据GenBank数据库公布的斜带石斑鱼神经坏死病毒的RNA2核苷酸序列，设计1对特异性引物。上游引物F：5′-CCTGCAGGTCGACTCTAGATAATCCATCACCGCTTTGCAAT C-3′；下游引物R：5′-GTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGCCGAG TTGAGAAGCGATC-3′，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。预期扩增片段约为1 433 bp。

1.2.3 RT-PCR

以提取的RNA为模板，利用反转录试剂盒进行cDNA的合成。并以此为模板进行PCR扩增，反应条件为：98℃ 2 min预变性；98℃ 10 s，65℃ 30 s，72℃ 2 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，凝胶回收目的基因片段。将回收产物与pUC-19载体连接，转化E.coliDH5α感受态细胞。细胞涂布在含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养平板上。从平板挑选40个单菌落进行菌落PCR鉴定重组子，产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，交由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，鉴定重组质粒中的插入序列。

1.2.4 系统发育树的构建

将测序所得基因序列在NCBI上的BLAST程序进行相似性比对，挑选一些较高相似性的序列，运用MEGA 4.0软件的邻接法(Neighborhood-joining，NJ)构建系统发育树[17-18]。

1.3 RT-PCR反应的灵敏度

采用质粒DNA提取试剂盒从转化的E.coliDH5α中提取重组质粒，并计算所抽提的质粒浓度，以8倍的浓度梯度进行稀释。将不同稀释度的质粒作为模板，以sCPRi-RT-1 (5′-GCGAATCCGCAACCCC-3′)和tCPRi-RT-1(5′-CGTATCCGTCTGTTCCTGTC-3′)为引物进行PCR反应，同时PCR反应产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其灵敏度。

1.4 病毒的分离纯化

1.4.1 病毒粗提液

取-80℃保存的发病斜带石斑鱼，将鱼头组织充分研磨，加入0.01 mol/L PBS缓冲液(NaCl 137 mmol/L、KCl 2.7 mmol/L、Na2HPO410 mmol/L、KH2PO42 mmol/L，pH 7.4)，匀浆器充分匀浆。匀浆液在-80℃与25℃反复冻融3次，于4℃、5 000 rpm离心15 min，收集上清液。获得上清液用PBS缓冲液稀释10倍后，加入双抗(100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素)，4℃静置过夜。0.22 μL滤膜过滤，即获得病毒粗提液。

病毒粗提液中加入氯仿(V∶V=1∶10)，剧烈震荡后，于4℃、5 000 rpm离心15 min，收集上清液。上清液于冰浴下，边搅拌边缓慢加入NaCl和PEG6000(聚乙二醇)，使得终浓度分别为0.5 mol/L和10%，4℃静置过夜。于4℃ 35 000 rpm离心2.5 h，沉淀病毒，-20℃冻存备用。

1.4.2 电镜观察

取NNV病毒原液用生理盐水悬浮，取1滴滴在铜网上，滤纸干燥，加1滴磷钨酸进行负染2 min，滤纸吸干，电镜(7600HC，德国Zeiss公司)观察。

1.5 不同细胞的敏感性

将长成单层的细胞分散转移到96孔细胞培养板，在无CO2、27℃的细胞培养箱中培养(设置正常细胞对照组)，每天观察细胞病变(Cytopathic effects，CPE)直至对照细胞开始老化为止。将上述病毒原液分别接种长满单层的E11细胞和大黄鱼细胞，两种细胞均置于27℃培养，逐日观察细胞病理变化。

1.6 病毒确认

为进一步确认人工感染实验中细胞病变是由NNV引起，利用细胞进行PCR扩增及克隆测序，与NNV进行比对。

2 结果

2.1 克隆与测序

经筛选和菌落PCR(图1)筛选出阳性菌株，斜带石斑鱼神经坏死病毒RNA2核苷酸序列的测序结果显示，测序得到的序列大小为1 433 bp，将序列提交到GenBank获得登录号为MF510920。RNA2含有一个编码病毒的主衣壳蛋白(Major capsid protein，MCP)，编码全长1 017 bp，编码的蛋白由338个氨基酸组成。

2.2 序列分析

将所得基因序列与GenBank数据库的4种基因型14株神经坏死病毒外壳蛋白进行同源性比较(表1)，小嶝岛病毒株XMNNV和赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)基因型病毒株的相似率达98.95%，其中与斜带石斑鱼神经坏死病毒的同源性最高，只有15个核苷酸的差异；与条斑星鲽神经坏死病毒(BFNNV)基因型病毒株的相似率为82.38%～82.52%；与拟鲹神经坏死病毒(SJNNV)基因型病毒株的相似率为78.09%～78.57%；与红鳍东方鲀神经坏死病毒(TPNNV)基因型病毒株的相似率为45.45%～79.14%。

选取一些相似性较高的序列，对XMNNV与4种基因型14株神经坏死病毒外壳蛋白基因进行分子进化分析，通过MEGA 4.0软件构建系统发育树。结果显示(图2)，XMNNV处于赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)基因型主干分枝上，并且与RGNNV处于同一分枝上，系统发育关系最为密切，而与BFNNV、SJNNV和TPNNV等3种基因型亲缘关系较远。因此病鱼斜带石斑鱼的神经坏死病毒应该属于RGNNV基因型。

表1 用于分子进化分析的病毒株

续表1

2.3 RT-PCR检测方法的建立及灵敏度分析

用建立的RT-PCR法进行检测，同一次试验中，对8个不同稀释度的阳性样品进行PCR扩增。产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳的检测结果显示(图3)，2.2×106～67copies分子均能出现明显的检测带，扩增产物的量随着模板的降低而减少。本研究建立的检测神经坏死病毒的方法灵敏度能够达到67 copies级核酸，而低于0～67 copies的核酸量看不到明显的条带。以上结果表明，本研究所建立的NNV RT-PCR检测方法，可进行稳定、可靠的检测。

注：1～8分别为2.2×106～0 copies/μL核酸样品。

Note：1～8 were 2.2×106～0 copies/μL nucleic acid samples，respectively.

2.4 病毒电镜观察结果

将病毒超速离心后悬浮，滴铜网染色，干燥后电镜观察病毒负染结果(图4)显示，病毒直径大小约为20～25 nm，结构为正二十面体。

2.5 不同细胞的敏感性

接种病毒的E11细胞在27℃培养后有CPE产生，形态如图5所示：细胞表现浑圆和空泡化病变，并最终导致细胞分解死亡。接种病毒的大黄鱼肌肉细胞在27℃培养后产生CPE，细胞变圆，部分溶解，并慢慢从培养皿壁脱落，最终解体死亡。对E11细胞与大黄鱼细胞接种瓶中的细胞做PCR，结果显示为阳性。

注：1.正常E11细胞对照组；2.感染的E11细胞；3.正常大黄鱼细胞对照组；4.感染的大黄鱼细胞。

Notes：1.Normal control；2.Infected E11 cells；3.Normal control；4.InfectedLarimichthyscroceacells.

3 讨论

近年来，随着我国海水鱼类工业化养殖的逐步推进，石斑鱼养殖产业的快速发展，长期肆虐的鱼类NNV也呈现出暴发的潜在趋势，给水产养殖业带来了巨大的经济损失。病毒病是鱼类疾病中最难以治疗的一类疾病，主要是以预防为主，因此对鱼类NNV的监测是控制并消灭鱼类NNV的重要前提。已证实鱼类NNV的传播有垂直和水平两种传播途径[19-21]，其中垂直传播是最主要的传播途径，Kuo等[22]研究报道病毒可存在于受精卵的卵膜内，而碘试剂只能消毒作用于受精卵表面，无法彻底切断病毒的垂直传播。有关研究对石斑鱼育苗组织的病毒分布检测结果显示，石斑鱼育苗的脑、视网膜、鳃、心脏、肝和肠的血细胞中均会有分布[23]，对石斑鱼育苗生产过程NNV传播途径中的亲鱼、卵、饵料等关键环节开展病毒检测是防治NNV的关键。

迄今，已经建立的很多关于检测NNV的方法：酶联反应吸附实验、荧光抗体实验、细胞培养、分子生物学等都被用于神经坏死病毒的检测中。其中，分子生物学检测方法在水产养殖业病原诊断中快速发展，而且随着方法以及技术的不断优化与更新，其已成为疾病诊断的主要手段。聚合酶链式反应技术(PCR)问世以来，凭其灵敏性、特异性和快速性而被广泛应用于分子生物学等领域。Nishizawa等[24]首次建立了鱼类诺达病毒的PCR检测法，扩增出外壳蛋白的部分基因序列，随后学者们相继开展了该病毒外壳蛋白的研究。荧光定量RT-PCR[25]和反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)[26]都有报道能够准确地检测鱼类NNV，但仍然存在一些局限性。荧光定量RT-PCR检测的灵敏度高，但需要的仪器复杂，对操作人员水平要求也较高，不能满足现场应用；LAMP检测使用染料法对扩增产物进行显色，容易出现假阳性的情况，特异性较差。鱼类病毒性神经坏死病危害性广、复杂度高、发病快，因此针对其建立一种操作简便、检测周期短且特异性强的现场快速检测方法，为我国水产养殖业的健康发展提供保障是非常有必要的。

本研究根据GenBank数据库公布的斜带石斑鱼神经坏死病毒的RNA2核苷酸序列，设计了1对引物，扩增出编码全长为1 017 bp病毒的主衣壳蛋白，编码的蛋白由338个氨基酸组成。依据NNV外壳蛋白核酸序列，NNV分为4种基因型[14]，将XMNNV与4种基因型中的14株病毒株进行同源性比对和分子进化分析，结果显示，XMNNV与RGNNV外壳蛋白核酸序列相似率最高，达到98.95%，并且在分子系统进化树中与RGNNV的亲缘关系较其他3种基因型的病毒更近。通过序列的多重比对与分析，证明小嶝岛分离株XMNNV与其它的RGNNV存在一定的基因序列差异，这可能是因为鱼类神经坏死病毒在传播的过程中，其RNA基因组不稳定，容易产生变异现象[27]。本研究建立了RT-PCR技术，用于临床NNV诊断，同时，根据NNV衣壳蛋白的核酸序列设计引物，通过试验检测，对8个稀释度的样品进行定量RT-PCR扩增，最小可检出67个病毒拷贝数，表明其具有优良的稳定性和可重复性。

进一步研究探讨病毒本质并对病毒性疾病进行诊断，制备获得纯净的病毒，对病毒颗粒的物理化学性质和病毒遗传物质结构的深入研究至关重要，其中，超速离心法提纯病毒是一种很有效的手段，在国内外也已有大量的研究。Chi等[23]采用了超速离心法对来源于斜带石斑鱼鱼鳍细胞GF-1培养的石斑鱼神经坏死病毒(GNNV)进行了纯化；黄剑南等[28]也采用了超速离心法对赤点石斑鱼诺达病毒RG-CN进行了纯化。本研究采用超速离心法从患病斜带石斑鱼中分离得到NNV，观察病毒的形态特征，结果显示，病毒直径大小约为20～25 nm，结构为正二十面体。在E11细胞系及大黄鱼细胞的感染实验中表现出了较强的致病性。有研究者证明，不同地理株型的鱼类神经坏死病毒对于不同的鱼种致病力有差异[29]，而小嶝岛分离株XMNNV的感染结果证明其具有较强的致病力。

本研究中，从患病斜带石斑鱼中分离得到NNV，并在克隆出NNV核酸序列的基础上，建立了石斑鱼神经坏死病毒RT-PCR灵敏度分析，该方法具有操作简单、特异性强、检测周期短、稳定性好等优点；并进行了病毒感染细胞实验，以期为今后在石斑鱼养殖产业中进行病毒检测提供技术支持，同时为石斑鱼苗种培育生产中神经坏死病毒病的防治奠定基础。