双歧杆菌和乳酸菌β-半乳糖苷酶转糖基作用的研究进展

姜陈波，杭 锋*

（乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436）

半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）可作为生物催化剂水解乳糖，广泛应用于乳品加工、食品加工、制药领域等[1]。除了水解反应以外，具有转糖基活力的β-gal还能参与转糖基反应，产生益生元低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）[2]。GOS因其具有显著调节肠道菌群、提高有益菌双歧杆菌的数量和代谢活力、减少有害菌吸附、调节肠道免疫系统以及治疗代谢疾病的作用，在益生元领域引起广泛关注[3]。

商业GOS一般以乳糖为底物，通过β-gal转糖基反应，产生具有不同聚合度和糖苷键的复杂GOS混合物，该过程依赖于酶的来源和作用条件[4]。β-gal在自然界中普遍存在，其来源包括动物、植物和微生物，一般而言微生物来源β-gal的生产率更高，可以显著降低生产成本[5]。因此，尽管在多种来源中发现β-gal，仍普遍采用微生物源β-gal合成GOS[6]。微生物源β-gal包括曲霉属（Aspergillus）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、乳杆菌属（Lactobacillus）以及双歧杆菌属（Bifidobacterium）等，这些来源的β-gal已作为生物催化剂应用于GOS的合成反应[7]。

在多种微生物源β-gal中，Aspergillus和Kluyveromyces菌株产生的β-g a l在工业中应用范围最广[8]。但双歧杆菌（bifidobacteria）和乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）来源的β-gal在生产GOS方面也具有非常重要的价值，是β-gal较好的来源，且越来越受到关注。首先双歧杆菌和LAB均被认为是“一般认为安全（generally recognized as safe，GRAS）”的微生物，在食品发酵领域具有较长的应用历史。此外，研究发现利用乳酸菌β-半乳糖苷酶（lactic acid bacteria β-galactosidase，Lβ-gal）和双歧杆菌β-半乳糖苷酶（bifidobacteria β-galactosidase，Bβ-gal）合成的GOS将最有可能选择性促进这两类菌在肠道中的生长，提高菌株在肠道内的代谢活力，从而增加益生作用[9]。

近年来，国内关于β-gal的综述性报道较少，国外则较为全面[1,5]，但针对Lβ-gal和Bβ-gal这两类来源及其合成GOS的总结报道较少。因此，本文针对Lβ-gal和Bβ-gal转糖基作用合成GOS的研究进展，总结了能够产生具有转糖基活力β-gal的双歧杆菌和乳酸菌菌株，分析比较了两类来源的β-gal的酶学性质，并重点阐明了β-gal以乳糖为底物在合成GOS中的应用，为开发Lβ-gal和Bβ-gal及其应用提供理论指导。

1 β-gal转糖基作用合成GOS

近年来，GOS因其具有多种益生功能，且在较广的pH值和温度范围内具有稳定性，而受到广泛关注[10]。GOS的分子链含有2～8 个单糖，末端为1 个葡萄糖分子，剩余部分为半乳糖；此外，通过转糖基作用由2 个半乳糖组成的二糖也属于GOS[6]。GOS被认为是具有有益作用的益生元成分，可不被水解或消化直接从人体上肠道到达大肠，选择性促进肠道中有益菌双歧杆菌和乳杆菌的生长，以及抑制肠道致病菌的生长[11]，从而改善肠道菌群的组成，对免疫反应和代谢综合征标志物产生积极作用[12-14]。此外，肠道微生物在结肠中发酵GOS的产物包括乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等短链脂肪酸，这些产物给结肠上皮提供能量，降低了结肠pH值，促进了钙、镁的吸收，以及降低了促炎反应标志物的水平[15-17]。

目前，主要通过糖苷水解酶的转糖基作用，以乳糖为底物，产生具有不同聚合度和结构的GOS混合物以及未参与反应的乳糖和单糖（葡萄糖和半乳糖）[18]。在GOS的工业化生产中，β-gal发挥着极其重要的作用，其形成GOS的具体作用机制见图1。首先1 分子乳糖和β-gal的活性位点结合，释放葡萄糖残基，剩下的β-gal-半乳糖基复合物进行下一步反应。接着，该复合物转移到含有羟基的糖类或水分子受体上，当溶液中乳糖浓度较低时，将促进水分子作为受体，产生半乳糖；而当溶液中乳糖浓度较高时，则乳糖等作为受体连接该复合物，最终产生GOS[5]。当乳糖作为受体时，通过转糖基作用可产生聚合度为3的GOS（β-D-Galp-(1→x)-β-D-Galp-(1→4)-D-Glcp），该GOS可再次作为受体底物，重复经历转糖基过程。因此，转糖基反应可产生具有不同结构的GOS混合物[3]。

图1 β-gal合成GOS的反应[5]Fig. 1 Reaction route for the synthesis of GOS by β-gal[5]

2 具有转糖基活力Lβ-gal和Bβ-gal的来源和酶学性质

2.1 具有转糖基活力Lβ-gal和Bβ-gal的来源

部分双歧杆菌和LAB菌株能够产生具有转糖基活力的β-gal，这两类菌是筛选转糖基活力β-gal的较好来源[9]。表1总结了目前文献报道的具有转糖基活力Lβ-gal和Bβ-gal的来源。其中，能够产生具有转糖基活力β-gal的双歧杆菌包括长双歧杆菌（Bifidobacterium longum subsp. longum）、婴儿长双歧杆菌（Bifidobacterium longum subsp. infantis）、两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）、短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）、角形双歧杆菌（Bifidobacterium angulatum）、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）和假长双歧杆菌（Bifidobacterium pseudolongum）等。Lβ-gal的来源包括嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）和副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）等。

β-gal主要以全细胞、经过化学处理或物理处理的细胞、破碎细胞后获得的粗酶、粗酶经过进一步纯化获得的纯化酶、固定化处理的酶，以及通过大肠杆菌（Escherichiacoli）、巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）和L. plantarum等表达宿主菌获得的重组酶等不同形式存在。不同来源和不同形式的β-gal的酶学性质存在差异，从而对GOS的合成过程产生影响。

表1 Lβ-gal和Bβ-gal的来源Table 1 Microbial sources of Lβ-gal and Bβ-gal

2.2 具有转糖基作用的Lβ-gal和Bβ-gal的酶学性质

基于CAZy（carbohydrate-active enzymes）数据库，β-gal属于糖苷水解酶家族（glycoside hydrolase families，GH）1、2、35、42和59（GH1、GH2、GH35、GH42和GH59）[35]。双歧杆菌和乳酸菌中，仅在GH2和GH42家族中发现具有转糖基活力的β-gal（表2）。GH2家族中，大部分乳酸菌产生LacLM类型的β-gal，即由lacL和lacM两个基因编码形成的异源二聚体，包括L. pentosusKUB-ST10-1、L. acidophilusR22、L. plantarumWCFS1、L. sakeiLb790、L. reuteriL103等菌株[25]。而由单一lacZ基因编码的LacZ类型β-gal在乳酸菌中不常见，仅有少数乳酸菌属于这一类型，例如菌株L. bulgaricusDSM20081[29]。LacZ类型的β-gal在双歧杆菌中更为常见，例如B. bifidumNCIMB 41171、B. infantisHL96、B. breveDSM 20213和B. longumCCRC 15708等双歧杆菌菌株产生的β-gal均为LacZ类型[19,29-30]。此外，具有转糖基活力的Lβ-gal和Bβ-gal以GH2家族居多，只有少部分菌株属于GH42家族，例如分别来自B. bifidumNCIMB 41171的β-半乳糖苷酶BbgII[36]和B. infantisHL96的β-半乳糖苷酶β-GalIII[37]。这是由于GH2家族的β-gal可能更倾向于催化转糖基反应，因此该家族β-gal转糖基活力的研究一般得到更多关注[19]。

β-gal催化合成GOS是一个动力学控制的反应，该过程转糖基反应和水解反应同时发生[6]。但关于GOS合成反应的动力学参数米氏常数Km以及催化常数kcat的报道较少，这可能是由于GOS的形成速率很难准确计算。当Km用来计算转糖基作用时，通常需要的数量级远高于乳糖水解的数量级，例如B. bifidum β-gal的转糖基作用和乳糖水解的乳糖浓度分别为800 mmol/L和13 mmol/L，转糖基作用需要提供更高的乳糖浓度才能获得最大转糖基速率[38]。因此，相比于转糖基作用的动力学参数，关于乳糖水解的动力学参数报道更多，表2总结了具有转糖基活力的Lβ-gal和Bβ-gal的乳糖水解的动力学参数以及β-gal参与乳糖水解反应的最适pH值和温度。

表2 Lβ-gal和Bβ-gal的酶学性质Table 2 Enzymatic properties of Lβ-gal and Bβ-gal

3 Lβ-gal和Bβ-gal合成GOS的应用

3.1 产生的GOS特点

β-gal的来源可能是影响GOS合成最重要的因素，决定了GOS的产量、产物的组成以及β-糖苷键的类型[11]。

3.1.1 GOS产量

在文献中关于GOS的产量有多种定义，较常用的定义是GOS质量浓度（g/L）和初始乳糖质量浓度（g/L）的比值[15]，在本文中即采用该定义表达GOS产量。表3列举了不同来源的Lβ-gal和Bβ-gal，以乳糖为底物合成GOS的反应条件和最大产量。由表3可知，在不同的过程参数下，源自不同菌株的Lβ-gal和Bβ-gal转糖基作用产生GOS的量在10%～70%之间不等。一般而言，GOS产量超过50%的β-gal较不常见，合成过程经过优化后，获得的产量约在30%～40%之间[24]。表3中总结了目前报道的几个GOS产量超过50%的Bβ-gal和Lβ-gal，例如，源自B. infantisHL96菌株的β-galI，合成的GOS产量达到63%[39]。B. bifidumNCIMB41171β-gal无论是存在于完整的细胞中，还是以重组酶BbgIV形式存在，其GOS产量均超过50%[9]。在乳酸菌中，S. thermophilusDSM20259[24]和L. bulgaricusDSM20081[29]菌株产生的β-gal，合成的GOS产量达到50%左右，是乳酸菌中GOS产量较高的菌株。但也存在GOS产量较低的β-gal，例如L. pentosusBFP32β-gal合成的GOS产量较低，当以粗酶液作为催化剂，GOS产量仅为13.9%[42]。Lβ-gal和Bβ-gal转糖基活性存在菌株特异性，其中部分β-gal合成GOS的产量甚至超过60%，高于Aspergillus β-gal和Kluyveromycesβ-gal等常见来源[43]，因此可以深入探究这两类来源的β-gal的特点，并应用于GOS的工业生产。

表3 Lβ-gal和Bβ-gal不同反应条件下的最大GOS产量Table 3 Maximum GOS yield produced by Lβ-gal and Bβ-gal under different reaction conditions

3.1.2 GOS组成及键接方式

Lβ-gal和Bβ-gal以乳糖为底物合成的GOS结构为Galn-Lac；此外，也存在Gal-Gal的二糖结构（表4）。产物GOS的聚合度普遍在2～5之间。例如，L. acidophilusR22β-gal合成的GOS中非乳糖二糖、三糖和四糖分别占总糖质量的15.5%、19%和4%[32]。L. plantarumWCFS1β-gal的GOS产物中非乳糖二糖、三糖和四糖的占比分别为19%、21%和1.3%[40]。B. bifidumNCIMB 41171β-gal合成的GOS混合物，除了含有二糖（25%）、三糖（35%）、四糖（25%），还有15%的戊糖[21]。

商业GOS例如Elix’or的糖苷键类型主要为β-1,4糖苷键，和Lβ-gal合成的GOS存在较大的区别[40]。表4总结了不同来源Lβ-gal和Bβ-gal合成的GOS产物的组成和键接方式。Lβ-gal倾向于合成β-1,6和β-1,3糖苷键连接的GOS。其中这几株LAB菌株，包括L.bulgaricusDSM20081[29]、L.reuteriL103[33]、L.plantarumWCFS1[40]和L.sakeiLB790[31]产生的Lβ-gal尤其倾向于合成β-1,6糖苷键连接的GOS；此外，在双歧杆菌中也存在类似现象，将B. breveDSM 20213菌株中的lacZ基因在E. coli中表达，获得两种纯化后的重组酶β-gal I和β-gal II，两种酶通过转糖基作用产生的主要GOS产物为二糖β-D-Galp-(1→6)-D-Glc和三糖β-D-Galp-(1→3)-D-Lac，都是通过β-1,6和β-1,3糖苷键连接的，两种糖的总量分别超过GOS总量的75%和65%，而通过其他糖苷键连接的GOS产物则较少，仅产生极少量β-1,4糖苷键连接的三糖β-D-Galp-(1→4)-D-Lac[19]。但Bβ-gal产物中也存在主要通过β-1,4糖苷键连接的GOS产物，例如B. longumRD47菌株β-gal合成的三糖和四糖中，均存在β-1,4糖苷键[15]。相比于Lβ-gal，Bβ-gal合成的GOS糖苷键类型更具多样化。

表4 Lβ-gal和Bβ-gal产生的GOS结构特点Table 4 Structural characteristics of GOS produced by Lβ-gal and Bβ-gal

3.2 影响GOS合成反应的因素

β-gal的来源是影响GOS合成最重要的变量，决定了GOS的产量、产物的组成以及β-糖苷键的类型。除此之外，酶的形式、反应条件等也会影响GOS的合成[46-47]。本文重点从反应时间、乳糖浓度、反应温度、热稳定性酶的应用、固定化酶这5个方面，分析总结影响GOS合成反应的因素。

3.2.1 反应时间

β-gal以乳糖为底物合成GOS的反应过程中，GOS的合成和降解反应同时进行，GOS产量和组成不断发生变化，因此需要了解反应时间历程（乳糖转化）以获得最大的GOS产量[18]。L. bulgaricusDSM20081β-gal在合成GOS过程中，反应开始时主要形成三糖，包括β-D-Galp-(1→3)-D-Lac和β-D-Galp-(1→6)-D-Lac。随着反应的进行，葡萄糖和半乳糖的量稳定增加，这部分单糖成为转糖基反应的重要受体，部分非乳糖二糖开始形成，例如β-D-Galp-(1→6)-D-Glc和β-D-Galp-(1→3)-D-Glc是该阶段两种主要产物。反应过程中GOS产量也随着时间延长不断发生变化，当反应时间为12 h时，GOS的产量最高，接近50%，但在此之后，由于β-gal也能够水解GOS，GOS浓度出现下降，反应时间达到24 h时，GOS产量约降低了10%[29]。B. breve DSM20213 β-gal I和β-gal II两种酶在合成GOS时，分别在6 h和22 h之后获得最大GOS产量，但之后GOS浓度也出现了下降，尤其是β-gal I更为显著[19]。因此，终止反应的时间点相当严格，要尽可能接近最大GOS产量的时间点，以降低GOS的损失。

3.2.2 乳糖浓度

一般情况下，增加初始乳糖浓度有利于GOS的合成。初始乳糖浓度对GOS合成过程的影响主要表现在两个方面：一方面增加了半乳糖基受体数量，提高了GOS的合成速率；另一方面降低了水分活度，从而降低了GOS的降解速率以及乳糖水解速率[38]。但当初始乳糖浓度过高时，GOS的产量出现下降。例如，利用L. plantarum 79810菌株的β-gal合成GOS时，当初始乳糖质量浓度从200 g/L升高到400 g/L时，反应体系中转糖基反应逐渐占据主体，但随着乳糖质量浓度的进一步增加，GOS产量减少[27]。B. longum BCRC 15708菌株的β-gal催化反应中，当乳糖初始质量浓度从50 g/L增加到400 g/L时，GOS产量不断增加，质量浓度为400 g/L时，产量最高，但随着乳糖质量浓度进一步增加，GOS产量出现减少，与L. plantarum 79810菌株的反应趋势一致[44]。而出现该现象的原因，可能是由于高浓度乳糖底物，伴随着高含量半乳糖和葡萄糖转糖基产物的产生，而这两种产物是β-gal的竞争性抑制剂，从而降低了GOS的合成[27]。因此，在一定范围内提高初始乳糖浓度有利于提高GOS产量。

3.2.3 反应温度

提高温度有利于促进GOS的合成，主要原因是由于温度的升高增加了反应速率和底物的溶解度。例如，Geiger等[24]将S. thermophilus DSM20259菌株中编码β-gal的lacZ基因，在L. plantarum中表达获得重组β-gal粗酶提取液后，分别在37 ℃和50 ℃条件下合成GOS，在50 ℃条件下反应5 h，GOS产量接近总糖的50%；当反应温度降低到37 ℃时，需要反应8.5 h才能达到50%的产量。但不同来源β-gal的适宜反应温度范围具有菌株特异性，Zhang Hongzhi等[27]以超声破碎处理后的L. plantarum 79810菌株作为β-gal源合成GOS，当反应温度分别为30、37、45 ℃和50 ℃时，GOS的最高产量分别为26.5%、36.8%、43.5%和15.6%；当温度从30 ℃升高到45 ℃时，乳糖转化率从46.85%升高到78.25%，GOS产量逐渐增加；但随着温度从45 ℃升高到50 ℃，GOS产量出现显著下降。此外，温度可能对GOS产量无显著影响。Nguyen等[29]利用L. bulgaricus的β-gal合成GOS时，反应温度对GOS产物的最大产量以及组成影响很小，温度为30、40、50 ℃时，产量分别为49.5%、48.7%、48.2%；GOS混合物的主要组成成分未发生改变，且产量只发生微量变化。因此，针对不同来源的β-gal，需探究适宜的反应温度以提高GOS产量。

3.2.4 热稳定性酶的应用

升高温度通常能够促进GOS产生，但β-gal的热稳定性可能限制其在工业化规模上的应用；因此许多学者针对热稳定性酶的来源和特性展开重点研究[48-49]。热稳定性β-gal在应用时，提高反应温度、增加初始反应乳糖浓度，不仅可提高GOS产量，同时能够限制其他微生物的污染[38]。目前普遍认为，来自嗜热微生物的β-gal在较高温度下转糖基活力较高，是适于合成GOS的生物催化剂；而来自乳酸菌和双歧杆菌的β-gal合成GOS的反应温度一般不超过55 ℃。然而，Osman等[9]首次在双歧杆菌B. bifidum NCIMB 41171菌株中分离纯化出一种β-半乳糖苷酶BbgIV，它能够在65 ℃条件下有效合成GOS，最大GOS产量达到54.8%，高于一般水平。GOS生产率在65 ℃条件下达到35.1 g/（L·h），远高于生产率分别为4.8、12.7、24.3 g/（L·h）和18.2 g/（L·h）的菌株布勒掷孢酵母（Bullera singularis）、B. infantis HL96、米曲霉（Aspergillus oryzae）和海栖热袍菌（Thermotoga maritima）；该发现实现了Bβ-gal在65 ℃高温下合成GOS的可能，说明Bβ-gal在合成GOS方面具有很大的潜力。

3.2.5 酶的固定化处理

除了筛选热稳定性强的Lβ-gal和Bβ-gal以外，酶的固定化处理也可提高β-gal的稳定性。固定化处理是将酶限制在一定区域内，保留催化活力，从而增加酶的稳定性和可重复利用性，其核心的技术问题在于载体材料的制备与选择[50]。关于Bβ-gal的固定化研究较少，Osman等[47]首次将B. bifidum NCIMB41171菌株产生的β-半乳糖苷酶BbgIV固定化处理后合成GOS，相比于游离的BbgIV，DEAE纤维素、Q-琼脂糖凝胶和氨基乙基琼脂糖固定化BbgIV在45 ℃和55 ℃下稳定性提高；其中，Q-琼脂糖凝胶固定化BbgIV在45 ℃和55 ℃下反应仅2 h即获得最大产量的GOS（49%～53%），而游离BbgIV合成最大产量GOS（49%～53%）则分别需要20 h和16 h；此外，Q-琼脂糖凝胶固定化BbgIV在55 ℃高温下重复使用6 次后，活力仍保留了67.5%。因此，固定化处理也将会对GOS合成成本产生重要的影响。

4 结 语

双歧杆菌和乳酸菌被认为是GRAS微生物，是β-gal较好的来源，在生产GOS方面具有非常重要的价值。目前，Clasado公司利用B. bifidum NCIMB41171菌株产生的GOS已经实现商业化生产，GOS质量分数达到48%[51]。此外，S. thermophilus菌株产生的β-gal在将乳清中的乳糖转化为GOS方面也有较好的应用[24]。

β-gal的来源和反应条件等影响GOS的类型、产量以及特殊糖苷键的形成。未来的研究方向，一方面需要进一步筛选转糖基活力高的Lβ-gal和Bβ-gal，充分利用高乳糖含量的乳清等乳制品工业废弃物，优化反应过程，提高GOS产量和纯度，从而减少乳清等对环境的污染，增加经济效益[52]；另一方面，在婴儿配方粉中通常添加GOS模拟母乳寡糖的结构和益生作用，但GOS结构的多样性显著低于母乳寡糖[3,53]。因此需要深入探究Lβ-gal和Bβ-gal酶学性质和产生的GOS特点，通过结构定点饱和诱变等生物工程技术，丰富GOS结构的多样性，从而扩大工业化应用。