荧光显微镜校准技术的现状分析

王 菲,张 玲,俞晓平,叶子弘

(1.中国计量大学 生命科学学院, 浙江 杭州 310018;2.中国计量科学研究院,北京 100013)

荧光显微镜利用紫外光或者蓝紫色光激发样本产生荧光,在黑暗的环境下观察和分辨样品中的某些物质及其性质[1]。市面上的荧光显微镜主要以落射式荧光显微镜为主,根据落射式荧光显微镜的工作方式又可以分为正置荧光显微镜和倒置荧光显微镜。图1展示的是正置荧光显微镜的光路示意图。以GFP通道为例,激发滤光片(1):仅让波长为450～490 nm的蓝紫色光通过;二向分色镜(2):将低于510 nm的光反射在样本上,并将高于510 nm的光透射过去;反射滤光片(3):去除不需要的荧光信号,通过520～560 nm的特殊绿色荧光,这样就实现了对较强的短波长激发光源的屏蔽,而仅允许通过更长波长的荧光,使得目镜系统仅获得荧光信号,而不受到其他光线的干扰。随着社会经济的发展需要,荧光显微镜现已应用在各领域,例如用于检测表征高分子形态、表面和界面[2];测试水中油浓度[3],分析岩芯图像[4],观察水生动物病毒[5],检测沥青质量[6],检验印文与字迹先后顺序[7],观察纤维切片[8]等。

图1 荧光显微镜的工作原理Figure 1 Working principle of fluorescence microscope

为确保荧光分析数据的准确性和可靠性,荧光显微镜校准技术应运而生,特别是在生物医学方面,校准技术的提高有利于分析病毒和细胞,提出解决方案。在药物分析与筛选中,不同药物对细胞形态和细胞荧光产生的影响;肿瘤组织发生发展、肿瘤细胞分化浸润等过程中,细胞形态和细胞荧光产生的变化;都需要荧光显微镜检测结果可以定量分析和比较。

本文介绍的是荧光显微镜校准技术的两个部分,一个是荧光显微镜的显微校准技术,主要是为了提高荧光成像的分辨率以及清晰度;另一个是荧光校准技术,主要是从荧光的角度分析提高显微镜之间的数据的可比性。

1 荧光显微镜显微技术的校准

荧光显微镜在观察荧光物质时,会通过CCD照相机检测荧光成像,然后根据荧光成像来分析荧光物质的性质,所处的位置以及荧光物质的数量,所以一台荧光显微镜能否达到实验的要求主要是看生成的荧光成像是否具有高分辨率和高清晰度。但近百年来,光学显微镜一直饱受“阿贝极限”的困扰,即光学显微镜的分辨率不能超过光波波长的一半,为了可以更进一步的观察,科研人员根据荧光显微镜的光源、滤色系统、光学系统以及成像系统提出改进措施或者是新的算法。

市面上应用的荧光显微镜光源一般都是汞灯或者超高压汞灯[9],在不替换光源的前提下,袁志伟[10]设计了一种用汞灯作为活化光源的三维超高分辨荧光显微镜的新型实验方法,该方法实现了亮暗状态的快速转换,减少成像所需时间,达到了40 nm的横向分辨率和100 nm的轴向分辨率的超高分辨荧光显微镜,并验证了其在细胞成像上的可行性。近年来,随着LED技术的发展,一些大型重点实验室也会选择使用LED灯来提高显微镜观察的分辨率同时用来校准荧光显微镜的视场清晰度[11],但是造价比较昂贵并没有得到普及。当然不同的实验要求需要使用不同的荧光光源,例如在追求紫外光激发效能的连续稳定性可以采取带状光谱特征的氙灯光源(细胞Ca2+测定)[12]。确定了发光源,接着可以通过减小孔径光阑提高光谱纯度降低单色光的能量[13],以提高光源光学系统的工作效率。

荧光显微镜显微校准技术最关键的部分还是校准荧光显微镜的成像系统,文桥等[14]提出一种用于荧光显微镜的正交偏振滤波图像增强技术,能够显著提高成像质量,丰富了从强激发光中提取弱荧光信号技术手段,且不受激发光与荧光波长的限制;任利强[15]提出了新的景深计算方法并确定了适用于荧光显微镜的自动对焦方法,实现了多层荧光图层融合,大幅度提高图像的信息量和对比度。这两种显微校准方法主要是针对免疫荧光提出的,该技术己广泛应用于病毒学、免疫病理学、寄生虫学、细菌学和肿瘤学等多个生物学和医学领域中。李云章等[16]设计了基于数字微镜器件(DMD)的荧光显微镜探测系统,不仅能对样品实现荧光成像,而且还能探测不同区域样品激发荧光信号能量的实时变化;常敏,刘天成[17]通过对显微采集原始图像进行灰度变换、直方图均衡化等处理方法从而快速准确地获取目标的图像特征,提高细胞定位精确度。这两种校准方法旨在获取荧光信号,特别是微小的不易观察的荧光信号,从而获取荧光成像对其进行荧光分析。曹国威等[18]利用荧光蛋白激活状态的可逆特性,提出一种提高荧光显微镜纵向分辨率的方法,针对不同数值孔径的显微系统,通过合理选择带涡旋相位的轴对称偏振光作为激活光和退活光,并设计衍射光学元件对其进行调制,从而实现百纳米级的纵向选择激活;鹿伟民[19]基于LED光源和可编程数字微镜阵列(DMD),设计和搭建了结构光照明超分辨率荧光显微镜,利用设计的结构光生成模块与奥林巴斯X73显微镜结合做成了SIM超分辨成像系统,并设计了SIM超分辨率重构算法。这两种校准方法都是为了突破“阿贝极限”而提出的新的算法,是一种简单可行的超分辨率成像方法。

近年来,随着计算机技术和工具的不断进步,学科的交叉和联系越来越紧密,荧光显微镜的成像技术大大提高[20],2014年美国科学家埃里克·贝齐格、威廉·莫纳和德国科学家斯特凡·黑尔,这三位科学家研究发明受激发射损耗(STED)荧光显微术和单分子荧光显微成像技术,从而突破了“阿贝极限”,将光学显微镜步入了纳米时代[21],可以说荧光显微镜的显微校准技术达到了一个新的顶峰。

2 荧光显微镜的荧光校准

荧光显微镜显微技术的校准主要是针对单个荧光显微镜的,为了让实验室之间以及仪器之间的荧光数据、荧光强度能够进行对比分析,还需要对荧光显微镜进行荧光校准,也对荧光显微镜的日常校准、稳定性、准确性评价提出新的要求。这些发展需要重新评估有效的仪器校准和鉴定程序,美国标准技术研究院(NIST),德国联邦材料研究检测院(BAM),法国的Argo light公司以及一些科研人员相继开发出比较实用的荧光显微镜校准玻片和新的校准方法。

美国NIST[22]开发的的校准玻片是在1 mm厚玻璃载片上涂层荧光薄膜,涂层厚度小于10 μm,532 nm和633 nm激发时,在250 μm2的区域内具有99%或更高的平均强度均匀性,并提供经认证的校正发射光谱。也就是说可以使用相同的校准对来校准两个不同的激发波长或者是根据波长的特征用标准对进行校准。微阵列材料标准设计如图2[22]。

图2 微阵列材料标准设计Figure 2 Design of material standards for microarrays

德国BAM的研究人员Brunner[23-24]提出了一种新校准工具的设计理念,校准玻片由不同定义的二次区域组成,区域内填充绿色和红色染料掺杂聚合物,根据扫描仪之间的定义参数确定荧光区域的染料掺杂聚合物的浓度范围并用未掺杂的非荧光聚合物测定背景信号,聚合物层内染料分布具有适当均匀性和足够的光稳定性。校准玻片如图3[24]。校准玻片可以有效定期地评估和控制微阵列扫描器生物芯片的性能,最终作为荧光强度标度用于分析结果和提高诊断测试整体的可比性。

图3 双色荧光校准玻片Figure 3 Two-color fluorescence calibration slide

法国Argo light[25-26]公司设计出一种用于性能评估和监控的新型校准工具,分为两个部分,硬件主要就是校准玻片,软件就是Daybook。校准玻片采用非荧光物质的透明材料进行3D激光光刻,玻片表面的光刻图形有靶形、格子形、竖条形以及交叉楼梯形,校准玻片如图4[26]。靶形校准玻片是用来校准成像嵌入位置;格子形和竖条形校准玻片是用来校准成像质量和重建正确性,也可测量横向分辨率;交叉楼梯形是用来校准共焦显微镜的光谱切片。

图4 Argo light显微镜校准玻片Figure 4 Microscope calibration slide from Argo light

Micheal Halter[27]等人使用铀酰离子掺杂玻璃和肖特475 GG过滤玻璃作为标准材料,设计一种自动化测试基准,通过将检测阈值、饱和度和线性动态范围与参考材料进行基准比较来表征荧光成像系统的性能。校准玻片如图5[27](肖特玻璃A是玻璃-聚合物复合材料,铀酰离子掺杂玻璃B是NIST标准物质(SRM[28])的改良组合物),其认证值可用于校正测量光谱形状失真的荧光发射光谱。基准测试程序针对放大率,检测器的物理像素大小和图像数据的位深度的差异进行归一化,以便可以在多种仪器配置上比较分析度量。

图5 肖特475GG玻璃(A)和掺杂铀的玻璃(B)粘在显微镜玻片上Figure 5 Cut and polished piece of the Schott 475 GG filter glass(A) and the uranyl-ion-doped glass(B) mounted to a microscope slide

显微镜校准玻片进行荧光显微镜校准时,固定夹片对玻片进行挤压,校准玻片会有轻微的弯曲,降低荧光显微镜校准的准确性。Jean[29-31]设计发明一种校准工具,以不透明的刚平面为支撑板,其上覆盖一层荧光固体和一层非荧光材料的薄金属膜,然后将光致抗蚀剂施加到金属层上,通过限定对准特征的精密掩模暴露工具对表面进行化学蚀刻以形成参考图案。荧光显微镜对准工具平面如图6[29-31],图6A[29]荧光校准平面主要用于校准荧光显微镜的轴,最终目的是为了量化荧光显微镜;图6B[30]荧光校准平面主要用于校准荧光显微镜的光学元件的样本位置或者校准显微镜中的荧光检测;图6C[31]荧光校准平面主要用于校准光轴或者处理近似平坦物体的轴的受限视野的物镜,包括可倾斜聚焦的透镜。

图6 荧光显微镜对准工具平面图Figure 6 Plan view of a fluorescent microscopy alignment tool

荧光显微镜的校准除了校准玻片的研究,也会有一些新的校准方法,比如SIP(Sectioned Image Property)校准方法以及德国汉诺威医学院的Malte Butzlaff[32]研究出的新型的校准方法eSIP(extended Sectioned Image Property)。SIP校准方法主要是通过对固体荧光层提取相关的图像信息,并从中获取参数进行分析。此方法虽具有为分段成像条件的一般表征提供基础的潜力,但仍然存在类似于噪声干扰的弊端,所以Malte Butzlaff提出了eSIP校准方法。eSIP校准方法是将荧光溶液样本代替SIP校准方法的固体荧光层样本,并对SIP参数(光学切片强度分布的半最大值FWHM)进行修改,从光子统计中获得记录的光子数允许随时间控制显微镜的性能,免受噪声干扰,还可以比较不同显微镜设置的灵敏度。

目前,各国机构对荧光显微镜的校准都展开了自己的研究,特别是仪器数据可比性方面。荧光校准需要考虑荧光染料、荧光强度、荧光光谱以及激发波长的差异,现存的校准方法或者校准玻片只是针对荧光显微镜的一个或几个方面,如此还需要对荧光显微镜的荧光校准进行更深入的研究。

3 结 论

总的来说,荧光分析为材料科学、环境分析、生物分析、分子遗传学、细胞生物学、医学诊断学和药物筛选作出了巨大的贡献,而荧光显微镜的校准技术就是为了给荧光分析提供保障。本文提出的荧光校准方法可以为以后开展相关的校准工作提供参考。