镉对胎盘绒毛外滋养层HTR-8/SVneo细胞内抗氧化酶活性的影响

李向阳，田青，董峰

山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006

随着工业化的发展，重金属污染问题日益突出，已经严重威胁到动物和人类的健康。其中，重金属镉（cadmium，Cd）伴随着采矿、冶金和电池制造等行业产生的废水、废气和废渣释放到环境中[1]，并通过生物富集和食物链进入动物和人类机体，造成胎盘、睾丸、肾、肝、肺、大脑和心脏等多个组织和器官损伤[2-5]。更重要的是，Cd 在动物和人类机体内不易排出，半衰期长达10～30年，具有潜在的致癌、致畸、致突变作用[6]。

胎盘是哺乳动物妊娠过程中的临时性器官，其主要作用是为胎儿传递营养物质、运输代谢产物和分泌激素[7-9]。胎盘的正常发育主要取决于滋养层细胞增殖和分化的正常进行[10]。胎盘的功能受损可能会引起先兆子痫、胎儿发育迟缓甚至流产[11-12]。研究发现胎盘对重金属Cd 具有一定的屏障作用，蓄积在母体胎盘中的Cd，只有极小的部分会穿过胎盘直接作用于胎儿[13]。Cd 可以引起小鼠滋养层细胞肿胀变形和空泡化，抑制细胞的增殖并增加其凋亡率，造成胎盘萎缩[14]。Cd 可以诱导胎盘JEG-3 细胞产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），引起胎盘内氧化与抗氧化失衡，阻碍胎盘的正常发育[15]。这提示我们，Cd可能通过增加胎盘内ROS，降低胎盘内抗氧化酶活性，进而影响胎盘的正常功能。因此，我们以HTR-8/SVneo 细胞为研究对象，检测Cd 对HTR-8/SVneo 细胞活性、形态、ROS 水平、抗氧化酶活性和丙二醛（malonyldialdehyde，MDA）含量的影响，为研究Cd的胎盘毒性提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

胎盘绒毛外滋养层HTR-8/SVneo 细胞购于ATCC，用含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素、链霉素）的RPMI1640 培养基，在37℃、5% CO2培养箱内培养。

RPMI1640 培养基购于Gibco 公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；氯化镉（CdCl2）购于Sigma公司；CCK-8 试剂盒购于博士德公司；ROS 检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）试剂盒和MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所；其他各类试剂均为分析纯试剂。

1.2 CCK-8检测细胞活性

收集对数生长期细胞，96 孔板内每孔接种1.0×104细胞，设置对照组和CdCl2处理组，每组设3 个重复孔。待细胞密度达60%左右时，加入不同浓度（0、3、6、12 μmol/L）CdCl2处理细胞24 h，或者用12 μmol/L CdCl2处理不同时间（0、6、12、24 h）；处理结束后，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，培养箱中避光孵育1 h，酶标仪检测D450nm值，计算细胞存活率。

1.3 显微镜观察细胞形态变化

收集对数生长期细胞，96 孔板内每孔接种1.0×104细胞，设置对照组和 CdCl2处理组、CdCl2与N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）共处理组，每组3 个重复孔。待细胞密度达60%左右时，用12 μmol/L CdCl2处理不同时间（0、6、12、24 h）；CdCl2与NAC 共处理组先用500 μmol/L NAC 预处理细胞2 h，然后加入 12 μmol/L CdCl2与 500 μmol/L NAC 共同处理细胞24 h。处理结束后，PBS 清洗细胞1 次，光学显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.4 ROS含量检测

收集对数生长期细胞，6 孔板内每孔接种3.0×105细胞，设置对照组和 CdCl2处理组、CdCl2与NAC 共处理组，待细胞密度达到60%左右时，用12 μmol/L CdCl2处理不同时间（0、6、12、24 h）；CdCl2与 NAC 共处理组先用 500 μmol/L NAC 预处理细胞 2 h，然后加入 12 μmol/L CdCl2与 500 μmol/L NAC 共同处理细胞24 h。处理结束后，PBS 清洗细胞 1 次，各孔加入 1 mL DCFH-DA 探针溶液（用无血清 RPMI1640 培养基 1∶1000 稀释），避光孵育30 min，收集细胞，用流式仪检测细胞内ROS 含量变化。

1.5 SOD、CAT、GPx活性及MDA含量检测

收集对数生长期细胞，每个10 cm 培养皿内接种2.0×106细胞，设置对照组和CdCl2处理组、CdCl2与NAC 共处理组。待细胞密度达60%左右时，用 12 μmol/L CdCl2处理不同时间（0、6、12、24 h）；CdCl2与 NAC 共处理组先用 500 μmol/L NAC 预处理细胞2 h，然后加入12 μmol/L CdCl2与500 μmol/L NAC 共同处理细胞24 h。处理结束后收集细胞，于冰上匀浆破碎细胞，12 000 r/min 离心10 min，上清液即为细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，按照试剂盒说明检测细胞内SOD、CAT、GPx 活性和MDA 含量变化。

1.6 数据分析

所有实验数据使用SPSS 17.0 软件进行单因素方差（One-Way ANOVA）分析，实验结果以mean±SEM 表示，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 CdCl2抑制HTR-8/SVneo细胞活性

如图1所示，HTR-8/SVneo 细胞经 0、3、6、12 μmol/L CdCl2处理 24 h，或经 12 μmol/L CdCl2分别处理 0、6、12、24 h 后，细胞活性随CdCl2浓度的增大或处理时间的延长而逐渐降低（P＜0.01），呈浓度和时间依赖性。

2.2 CdCl2引起HTR-8/SVneo细胞形态损伤

CCK-8 结果显示 CdCl2引起 HTR-8/Svneo 活性下降，本研究后续实验采用时间依赖模型探究CdCl2引起细胞毒性损伤的机制。如图2所示，对照组细胞呈典型的铺路石状；随着CdCl2处理时间的延长，细胞数量逐渐减少，细胞之间的间隙逐渐增大，并发生皱缩、变圆，有的细胞甚至脱落。经500 μmol/L NAC 与12 μmol/L CdCl2共同处理24 h 后，细胞皱缩、变圆现象减少，说明NAC 明显缓解了Cd 引起的HTR-8/SVneo 细胞形态损伤。

2.3 CdCl2激发HTR-8/SVneo细胞内ROS升高

图1 CdCl2对HTR-8/SVneo细胞活性的影响

图2 CdCl2对HTR-8/SVneo细胞形态的影响

12 μmol/L CdCl2分别处理HTR-8/SVneo 细胞0、6、12、24 h 后，用 DCFH-DA 标记细胞，通过流式细胞仪检测细胞内ROS 含量，结果见图3。随着处理时间的延长，细胞内ROS 含量逐渐升高。与对照组相比，12 μmol/L CdCl2处理 HTR-8/SV⁃neo 细胞 12 h 时，ROS 含量显著升高，约为对照组的 2.30 倍（P＜0.05）；处理时间达24 h 时，升高至对照的 2.97 倍。用 500 μmol/L NAC 与 12 μmol/L CdCl2共处理，发现 NAC 可 以有效抑制 CdCl2引起的HTR-8/SVneo 细胞内ROS 含量升高。

2.4 CdCl2造成HTR-8/SVneo细胞内抗氧化酶的活性降低

与对照组相比，经12 μmol/L CdCl2处理后，HTR-8/SVneo 细胞内 CAT、GPx 和 SOD 活性呈时间依赖性降低，在处理12 h 时CAT 活性开始出现显著性降低（图4A，P＜0.05），处理 24 h 时 SOD 和GPx 活性显著降低（图4B、C，P＜0.05，P＜0.01）。用500 μmol/L NAC 与 12 μmol/L CdCl2共处理，发现NAC 可以有效缓解CdCl2引起的HTR-8/SVneo细胞内抗氧化酶活性的降低。

2.5 CdCl2引起HTR-8/SVneo细胞脂质过氧化

如图4D所示，经 12 μmol/L CdCl2处理后，细胞内的MDA 含量逐渐增加，处理12 h 时MDA 含量显著性升高（P＜0.05），处理 24 h 时 MDA 含量与对照组相比差异极显著（P＜0.01），升高至对照组的 3.11 倍，说明 CdCl2引起了 HTR-8/SVneo 细胞脂质过氧化损伤。用500 μmol/L NAC 与12 μmol/L CdCl2共处理，NAC 可以有效抑制 CdCl2引起的HTR-8/SVneo 细胞脂质过氧化。

3 讨论

环境中的Cd 可通过多种途径如摄食、饮水和呼吸进入人体，对多个器官和组织造成损伤[2-5]。在妊娠期时，Cd 更易在胎盘中蓄积，并随着妊娠期的延长而蓄积量明显增加[16]。Cd 在胎盘中的蓄积，使得胎盘极易发生毒性损伤，已有研究表明Cd 能引起胎盘功能受损，并导致先兆子痫、胎儿发育迟缓甚至流产[14]。

图3 CdCl2对HTR-8/SVneo细胞内ROS含量的影响

图4 CdCl2对HTR-8/SVneo细胞内CAT（A）、GPx（B）、SOD（C）和MDA（D）的影响（*P＜0.05，#P＜0.05，**P＜0.01，##P＜0.01）

许多研究表明Cd 可以引起胎盘、肾脏、肝脏和大脑等多个器官和组织ROS 水平升高，引发氧化损伤[14,17-18]。汪纪仓等证实醋酸镉（CdAc2）能诱导大鼠肝脏细胞ROS 水平升高和形态变化，并且经抗氧化剂NAC 处理后，细胞的皱缩变圆现象明显减少[19]。本研究发现CdCl2能够造成绒毛外滋养层HTR-8/SVneo 细胞活性下降和形态学损伤，激发 HTR-8/SVneo 细胞内 ROS 生成；并且，ROS 清除剂NAC 与CdCl2共处理，显著抑制了CdCl2引起的HTR-8/SVneo 细胞形态损伤和活性下降。以上结果说明Cd 引起的HTR-8/SVneo 细胞活性下降和形态变化与Cd 激发的细胞内ROS 升高有关。

当细胞发生ROS 升高时会启动自身的抗氧化系统，包括多种抗氧化酶如SOD、CAT、GPx[20]，以及谷胱甘肽（GSH）、褪黑素、维生素C、维生素E[21-24]等。SOD 可以清除细胞内过多的超氧阴离子自由基，CAT 可以清除细胞内的H2O2[20]。GPx 可以催化细胞内天然抗氧化物GSH 转化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），从而达到清除多种自由基的作用[25]。体外实验发现Cd 可以引起A549 细胞内ROS 含量升高，并造成脂质过氧化损伤，最终耗竭细胞内的 SOD 和 GPx[26]；Cd 也可以降低 HepG2细胞内CAT的活性[27]。本研究发现随着CdCl2处理时间的延长，SOD、CAT、GPx的活性逐渐降低，可能是细胞内抗氧化酶在发挥清除ROS 作用时逐渐被消耗。CdCl2处理HTR-8/SVneo 细胞，引起CAT 活性在12 h 时开始出现显著性降低，而SOD和GPx 活性则在24 h 时出现显著性差异，其原因可能是在HTR-8/SVneo 细胞内，各种抗氧化酶的含量及其开始发挥清除自由基作用的时间上存在差异。MDA 是细胞受到脂质过氧化损伤时的标志分子[28]。在本研究中CdCl2处理12 h 时，HTR-8/SVneo 细胞内MDA 含量开始出现显著性升高，说明Cd 能够导致HTR-8/SVneo 细胞发生脂质过氧化。

以上结果证实Cd 引起HTR-8/SVneo 细胞内ROS 含量增加，消耗细胞内的 SOD、CAT、GPx 等抗氧化酶，并引发脂质过氧化损伤，NAC 则可以有效缓解Cd 引起的细胞内ROS 升高与抗氧化酶活性降低。本研究为阐明Cd的胎盘毒性机制提供了基础，为筛选治疗Cd 致胎盘毒性损伤的药物提供了思路。