胆囊结石患者血清microRNA表达谱及其意义

赵森峰，豆松萌，李崇辉，黄皑雪，张坦，邵宁生，刘博

1.解放军医学院，北京 100853；2.军事医学研究院 军事认知与脑科学研究所，北京 100850；3.解放军总医院 肝胆外科，北京 100853

胆囊结石是危害人类健康的常见疾病，并随着人们生活习惯、生存环境的改变而呈现增长趋势[1-2]。在我国，胆囊结石的发病率高达10%，其患者入院率高，达到普通外科入院率的11.5%。

microRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约22 个核苷酸的非编码单链RNA 分子，主要通过特定的匹配方式绑定到靶基因mRNA 3'端非编码区（UTR），降解靶向mRNA 或者抑制其翻译[3-4]。近年越来越多的研究表明miRNA 可在转录后水平调控基因表达，参与细胞增殖、分化、代谢、凋亡等细胞过程，与多种疾病的进展具有重要联系[5-6]。Yang 等[7]发现 miRNA 对胆囊结石的形成有重要影响，miR-133a、miR-891a 和miR-210 等在胆囊结石患者的胆囊组织中异常表达。

有关胆囊结石与血清miRNA的研究较少，基于此，我们利用miRNA 测序技术筛选胆囊结石患者与健康人血清中的差异表达miRNA，探讨其靶基因及潜在功能，为胆囊结石临床诊断及防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

采集2018年3～11月在解放军总医院肝胆外科因胆囊结石诊治的患者血清25 例（试验组），及在本院体检中心查体的健康人血清25 例（对照组）。试验组男10 例，女15 例，平均年龄（47.68±12.16）岁，平均体质量指数（body mass index，BMI）（23.66±2.98）kg/m2；对照组男 9 例，女 16 例，平均年龄（49.60±14.23）岁，平均BMI（24.41±3.54）kg/m2。两组患者的性别、年龄、BMI 等信息无统计学差异（P＞0.05）。纳入标准：①术后病理确诊为胆囊结石，且胆囊组织无急性炎症；②无病毒性肝炎、内分泌性疾病或自身免疫性疾病；③在3个月内未使用任何抗生素。排除标准：合并其他胆囊疾病：胆囊腺肌症、胆囊息肉、胆囊癌、急性胆囊炎、坏疽性胆囊炎。

TRIzol LS购于Invitrogen公司；M-MLV RT购于Promega公司；RiboLock RNase抑制剂购于Fer⁃mentas公司；dNTP购于Tiangen公司；大肠杆菌poly（A）聚合酶、10×大肠杆菌 poly（A）聚合酶反应缓冲液和ATP 购于New England Biolabs 公司；Thunderbird SYBR Green qPCR Mix 购于Toyobo公司；RT-PCR 及qPCR 引物由上海生工生物工程公司合成；cel-miR-39 由广州锐博公司合成。

1.2 血清收集

研究对象禁食12 h 后，于次日清晨经肘静脉采集外周血5 mL，采集后4℃静置0.5～1 h；4℃、1600 r/min 离心 10 min，上清液转移至 1.5 mL 无RNA 酶的 Eppendoff 管中；4℃、16 000 r/min 离心10 min，以彻底除去细胞碎片与杂质；将上清分装至 1.5 mL 无 RNA 酶的 Eppendoff 管中，于-80℃超低温冰箱中冷冻保存。

1.3 血清RNA提取及质量鉴定

每 0.25 mL 血清中加入 1 μL 1 μmol/L 外参cel-miR-39（5'-TCACCGGGTGTAAATCAGCTTG-3'），按TRIzol LS试剂说明书提取血清 RNA 后稀释于 15 μL DEPC 水中，-80℃保存。用Quawell Q5000检测RNA的浓度及D260mm/D280mm值 ，用 Agi⁃lent 2100 Bioanalyzer 测定其完整性。

1.4 miRNA测序

取研究组与对照组各4 例冻存血清miRNA，于干冰条件下当日送至北京安诺公司分析血清miRNA 质量，RNA 质量合格后对每例血清miRNA进行建库测序。

1.5 血清RNA逆转录

取 600 ng 血清 RNA，用 DEPC 水补至 12.8 μL，加入 12.2 μL 反应体系［包括 2.5 μL 10 mmol/L MnCl2、2.5 μL 10×大肠杆菌poly（A）聚合酶反应缓冲液、2.5 μL dNTP、2.5 μL ATP、1.0 μL QmiR-RT Primer（5'-GCGAGCACA GAATTA⁃ATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'）、0.5 μL 大肠杆菌 poly（A）聚合酶、0.5 μL M-MLV RT、0.2 μL RiboLock RNase 抑制剂］，混匀后30℃水浴逆转录90 min，70℃水浴灭活15 min，DEPC 水稀释至250 μL，-20℃保存。

1.6 qPCR

用Stratagene 公司的Mx3000P qPCR 仪检测待测miRNA的相对水平。取3 μL cDNA，加入17 μL 反应体系［反应体系包括10 μL SYBR Green qPCR Mix、6 μL DEPC 水、1 μL 待测 miRNA 引物（表1）］。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性 15 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 20 s，40 个循环。每个qPCR 重复3 次。

1.7 生物信息学分析

用PITA、miRanda 和TargetScan 预测差异miRNA靶基因，保留至少存在于2 种预测软件中的靶基因；对差异miRNA的靶基因进行GO（Gene Ontology）分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge⁃nomes）分析，GO 分析中，P≤0.05 为差异表达miRNA的靶基因在GO 条目中显著性富集。

1.8 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计软件进行分析处理，计量资料以x±s描述，2 组数据间比较采用t检验。计数资料以频数描述，2 组数据间比较采用卡方检验。P＜0.05 时具有统计学差异。

表1 qPCR所用引物序列

2 结果

2.1 样本miRNA序列分析

各样本序列长度主要集中于 20～25 nt，4 例试验组和4 例对照组血清miRNA 序列数量平均分别为 14 899 245 和 11 783 121 个 ，其 miRNA 种类平均分别为 686 和 633 个，差异 miRNA 共 16 个，均为下调（表2）。

2.2 GO和KEGG功能分析

差异 miRNA 预测靶基因共 5832 个，GO 分析显示，在生物过程上其主要富集于细胞转化、生物调节和代谢过程等，在细胞组成上其主要富集于细胞成分和细胞器成分等，在分子功能上其主要富集于结合和活性催化等（图1）。差异miRNA的靶基因KEGG 功能分析显示，其参与了122 条信号通路，主要包括环腺苷酸（cAMP）信号通路、催产素信号通路、生理周期通路等（表3）。

2.3 qPCR验证

随机挑取4 个差异表达倍数较大的miRNA（miR-1228、miR-1249、miR-3614 和 miR-766）进行qPCR，利用外参cel-miR-39 对其进行相对定量。结果表明 miR-1228、miR-1249、miR-3614 和miR-766 在胆囊结石患者血清中均下调，其表达变化趋势与测序结果基本一致，但miR-1228、miR-3614 和miR-766 在2 组间存在统计学差异，而miR-1249 无统计学差异（图2）。

表2 差异表达的miRNA

2.4 验证miRNA的靶基因功能分析

miR-1228、miR-1249、miR-3614 和 miR-766预测靶基因分别为 3965、566、153 和 101 个，参与GO 分析的靶基因分别为 3486、543、136 和 96 个，参与KEGG 功能分析的靶基因分别为2295、367、93 和 72 个，各 miRNA 预测靶基因在 GO 和 KEGG主要通路上的分布见表4。

图1 差异miRNA的靶基因GO分析

表3 差异miRNA的靶基因KEGG功能分析

3 讨论

越来越多的研究表明，miRNA 在疾病的发生发展中发挥重要作用，不论良性疾病，还是恶性肿瘤，其在分子水平上对疾病的发生具有重要影响[8-9]。我们通过基因测序技术，初步建立胆囊结石患者和健康人的血清miRNA 表达谱，发现了16个差异miRNA，预测并分析了其靶点及功能。另外，通过 qPCR 方法验证了 miR-1228、miR-1249、miR-3614、miR-766 在 2 组间差异趋势与测序结果基本一致，说明测序结果准确、可靠。

图2 2组miRNA相对差异水平（*P＜0.05）

表4 miRNA预测靶基因在GO和KEGG主要通路上的分布

Yang等[7]发现胆囊组织中miR-133a、miR-891a、miR-210 和 miR-200c 等异常表达，miR-210可以靶向调节ATP11A，从而可能影响胆囊结石的形成。本研究预测的血清差异miRNA的靶基因基本涵盖了Lammert 等[10-11]总结的胆囊结石相关致石基因，ABCG5、ABCG8、ABCB4、FXR、NR1H4 等重要致石基因均在其靶点预测范围中。

多数学者[12-15]认为miRNA 是胆囊结石形成的重要分子之一，因为胆固醇代谢异常对胆囊结石的形成具有决定性作用，而miRNA 可以影响胆固醇代谢过程。比如，miR-122a、miR-422a 可以抑制 CYP7A1的表达[16]、miR185 可以抑制 SREBP-2的表达[17]、miR-33a 可以促进 ABCA1的表达[18]，这些途径都会影响胆固醇合成、转化、转运等过程。本研究发现的部分血清差异miRNA 在胆固醇代谢过程中发挥重要作用，miR-223 可通过抑制HMGCoA-S1 和SC4MOL的表达而抑制胆固醇的合成，miR-223 也可以提高ABCA1的表达而促进胆固醇外流[19]；miR-24 可通过抑制SR-B1的表达而抑制胆固醇合成[20]。

综上，我们发现了胆囊结石相关新的血清差异miRNA，并采用生物信息学方法分析了其差异miRNA的靶点及功能，这对揭示胆囊结石形成的病理机制具有重要影响，有助于我们进一步深入探讨miRNA 对胆囊结石形成的具体分子机制。