猪脱细胞真皮基质与RV-23抗菌肽复合材料的制备及生物学特性初步研究

李文，季守平

军事医学研究院 卫生勤务与血液研究所，北京 100850

脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix，ADM）是组织再生修复材料的研发热点。ADM 是将人或动物的真皮组织用物理化学和生物方法去除表皮及皮内细胞成分后获得的细胞外基质成分，具有天然三维结构[1]。ADM的主要成分，如胶原蛋白、非胶原糖蛋白、弹力纤维、分散在弹力纤维中的黏多糖、蛋白聚糖和结缔组织糖蛋白都与创伤修复密切相关[2]。ADM 材料能够吸附血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF），维持其生物活性[3]。此外，ADM 降解产生的甘氨酰-组氨酰-赖氨酸（GHK）三肽，也具有促进胶原、黏多糖和蛋白聚糖合成，激发脯氨酸酶活性，促进血管生成等生物学功能，加速伤口愈合[4-5]。ADM 生物相容性好，不易损坏，具有良好的细胞亲和性。而且，ADM 成分结构与细胞生长的微环境相似，能诱导上皮组织再生，应用前景广阔[6]。按来源不同，ADM 可分为人ADM 和异种ADM。人ADM 免疫反应低、疗效好，但来源有限，难以在临床上大量应用[7]。因此，来源广泛、价格低廉的猪脱细胞真皮基质（porcine ADM，PADM）进入人们的研究视野。PADM 在皮肤的三维结构、生物性状和免疫特性等方面与人的相似，已在烧伤、整形、创伤修复等领域得到广泛应用[8-10]。但是，PADM 残留异种抗原（α-Gal 抗原）会引起较强的异种免疫反应。我们在前期研究中，用α-半乳糖苷酶清除α-Gal 抗原，获得低免疫原PADM。经国家食品药品监督管理总局检定，发现α-Gal 抗原清除率超过90%[11]。

为了避免伤口愈合和组织修复中可能发生的细菌感染，我们将抗菌肽RV-23 与PADM 微粒混合，制备兼具抗感染及再生修复功能的复合材料。RV-23 来源于加州红腿蛙[12]，由23 个氨基酸残基组成，具有α螺旋结构，可与细菌细胞膜结合，诱导细菌去极化，使细胞膜形成孔洞，导致细菌裂解死亡，具有广谱抑制细菌生长活性[13]。据报道，作为一种细菌选择性抗菌肽，RV-23 具有良好的血液相容性，不影响红细胞、血小板、白蛋白、凝血系统等血液成分的结构和功能[14]。但RV-23 单独使用对真核细胞也有一定的细胞毒性，阻碍了其临床应用。在本研究中，我们制备的PADM 和RV-23 复合材料具有较强的抗菌性和较低的溶血性，对真核细胞的毒性进一步减弱，且该材料稳定性强，作为新型医用抗菌敷料具有良好的使用价值和开发前景。

1 材料与方法

1.1 材料

人表皮角化细胞HaCaT 由本实验保存；人新鲜全血由解放军总医院第五医学中心输血科提供；PADM 薄片及粉末由本实验室制备；RV-23 抗菌肽由北京赛百盛基因技术有限公司合成；DMEM 培养基、MEM 培养基购自 Gibco 公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；增强型CCK-8 试剂购自碧云天生物技术有限公司；Tricine-SDS-PAGE 凝胶试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠购自Sigma 公司；TritonX-100 购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 制备PADM/RV-23复合材料

用无菌超纯水将抗菌肽溶解成1000 μmol/L的母液；将PADM 用纯水清洗3 次，每次1 h，用打孔器切成直径6 mm 厚度约1 mm的小圆片，在超净工作台中晾干，分别加入20、5、1 μL 抗菌肽溶液，在超净工作台上完全晾干，制备PADM/RV-23复合材料。

1.3 菌落计数

挑取大肠杆菌DH5α于10 mL LB 液体培养基中，200 r/min、37℃振荡过夜，待D600nm为0.5（2×108CFU/mL）时，用 PBS 稀释至 1/1000，吸取 100 μL 于 1.5 mL的 EP 管中，向 EP 管中加入 PADM/RV-23 复合材料，37℃孵育 2 h，用 PBS 稀释至 1/100，取 100 μL 涂固体 LB 平板，37℃倒置过夜培养，拍照计数。

1.4 溶血实验

人新鲜红细胞用生理盐水洗涤3 次，每次加入10 mL 生理盐水，混匀，2000 r/min 离心5 min。洗涤后，用PBS 稀释为1%压积的红细胞，向1.5 mL的 EP 管中加入 500 μL，再加入 PADM/RV-23 复合材料，用1%的TritonX-100 作为阳性对照，不加复合材料而只加PBS 作为阴性对照，37℃孵育 30 min，500 r/min 离心5 min，拍照，取上清液 100 μL 至 96 孔板中，检测D450nm值。

1.5 CCK-8真核细胞毒性检测

将HaCaT 或NIH-3T3 细胞消化、离心、计数，以5×103/孔的密度接种到96 孔板，37℃恒温培养至细胞汇合率为70%～80%，向EP 管中加入200 μL 无血清的DMEM（HaCaT细胞用MEM培养基）,加入PADM/RV-23 复合材料，37℃孵育2 h，加入含20%胎牛血清的DMEM，混匀后换到96 孔板中，继续培养24 h，加入增强型CCK-8 溶液，37℃孵育1.5 h，测D450nm值。

1.6 考马斯亮蓝染色

取10 mg PADM/RV-23 复合材料冻干粉末于EP 管中，加入 100 μL 去离子水，再加入 2×还原性Tricine 专用上样缓冲液100 μL，100℃煮沸8 min。配制16.5%的分离胶和夹层胶、浓缩胶，30 V 电压预电泳 10 min，再加入 20 μL 样品，30 V电压电泳60 min，然后100 V 电压电泳至溴酚蓝到达底部。电泳结束后，将Tricine-SDS-PAGE 胶放入烧杯中，加入考马斯亮蓝染色液，覆盖胶面，放置在水平摇床上染色过夜，倒出染色液，加入脱色液脱色4～6 h，加入去离子水浸泡，拍照。

1.7 统计学分析

采用SPSS 19 统计软件对实验结果进行分析，实验数据用x±s表示，采用t检验，P＜0.05 有统计学意义。

2 结果

2.1 PADM/RV-23复合材料具有较高的抗菌活性

由图1可以看出，PADM 和 PADM/RV-23 复合材料对细菌都有不同程度的抑制作用。随着RV-23 浓度的升高，PADM/RV-23 复合物实验组细菌存活越来越低，当RV-23 浓度为20 μmol/L时，细菌存活仅为（0.59±1.15）%，提示RV-23 复合PADM 后仍然具有较好的抗菌效果。

2.2 PADM/RV-23复合材料具备较低的溶血能力

据报道，抗菌肽在细菌细胞膜上打孔致使细胞破裂、死亡[15]，因此我们检测了PADM/RV-23 复合材料对红细胞的溶血能力，发现PADM 可以降低RV-23的溶血活性。无论复合材料还是RV-23 组，随着抗菌肽RV-23 浓度的升高，溶血活性都会提高，但同浓度相比，复合材料组的溶血活性低于RV-23 组（图2）。

以上结果提示，PADM 对RV-23的溶血性能具有很好的屏蔽作用，很大程度地减弱了抗菌肽RV-23 对真核红细胞膜的溶破作用。

2.3 PADM/RV-23复合材料对上皮细胞无副作用

图1 PADM/RV-23复合材料显著抑制细菌生长

由于PADM 敷料基本应用于伤口创面，我们检测了PADM/RV-23 复合材料对人表皮角化细胞HaCaT 和鼠成纤维细胞NIH-3T3的影响，结果发现RV-23 对2 种细胞的毒性随着浓度的升高而增加，PADM/RV-23 复合材料基本不影响HaCaT 和NIH-3T3的增殖（图3）。例如，对于HaCaT 细胞，RV-23 浓度为 20 μmol/L 时 PR20 组细胞活性为（103.97 ± 2.33）% ，单独RV-23组为（37.46 ±4.27）%。对于NIH-3T3 细胞，也取得类似结果。

2.4 PADM/RV-23复合材料性质稳定

将制备的复合材料室温保存1 个月，然后进行Tricine-SDS-PAGE，检测RV-23 是否降解。结果见图4，当PADM/RV-23 复合材料所含RV-23抗菌肽浓度分别为1、5 和20 μmol/L 时都有明显条带，说明该复合材料室温放置1 个月后RV-23仍然没有降解，提示该复合材料较稳定。

图2 PADM/RV-23复合材料对红细胞的溶血作用

图3 PADM/RV-23复合材料对上皮细胞的毒性

图4 抗菌肽RV-23的Tricine-SDS-PAGE

3 讨论

猪皮结构与人皮肤结构相似，具有保持伤口湿润环境、减少疼痛、促进痊愈、减少瘢痕形成等作用，可用于深度烧伤的治疗，但其临床应用的最大障碍是异种免疫排斥反应。脱细胞制备PADM 过程中，去除了大部分异种抗原，大大降低了免疫排斥反应。同时，PADM 保留了完整的胶原三维结构，不仅为再生修复提供支架，还可以调节细胞的迁移、增殖、分化，加快伤口愈合[16-17]，因此广泛用于创伤、烧伤治疗以及整形美容等领域[18]。目前市场上的PADM 有α-Gal 抗原，免疫原性高。为此，我们实验室用α-半乳糖苷酶清除PADM 上的α-Gal 抗原，制备了免疫原性更低、生物相容性更好的PADM。

感染是影响创面愈合的重要因素，而耐药菌感染不仅延误创伤治疗，而且有可能危及患者生命。在本研究中，我们将抗菌肽RV-23 和低免疫原PADM 结合，制备了PADM/RV-23 复合材料，评价其抗菌性、溶血性以及对HaCaT 和NIH-3T3 细胞的毒性。结果发现，该复合物在保留了较强抑菌作用的同时，还具备红细胞的溶血作用较低，对上皮细胞、成纤维细胞无毒性等优点，性质稳定，作为新型抗菌敷料具有良好的使用价值和开发前景。