猪瘟病毒荧光定量PCR的建立及对病毒体外复制动态的研究

王瑞宁 , 赵孟孟 , 李存法 , 李青梅 , 张雨杭 , 王 丽 , 李金磊 , 郭军庆 , 张改平,

(1.河南牧业经济学院动物医药学院 ， 河南 郑州 450046 ； 2.河南省农业科学院动物免疫学实验室 ， 河南 郑州 450002 ；3.河南农业大学牧医工程学院 ， 河南 郑州 450002 ； 4.河南省兽药饲料监察所 ， 河南 郑州 450008)

猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV) 是猪瘟的病原，属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员之一[1]，该病属于必须向世界动物卫生组织(OIE)报告的传染病，中国农业农村部将其列为一类动物疫病[2]，主要临床特征是稽留高热、出血、母猪流产等，是一种严重危害世界养猪业的高致死性、烈性传染病[3]。

目前对猪瘟防控尚无特效药物，虽然使用猪瘟弱毒疫苗能够很好的控制住猪瘟的大流行，但时常会有免疫失败的报道，其中一个重要原因就是疫苗效价不足问题。通过PK-15、ST细胞等增殖CSFV来生产猪瘟疫苗，CSFV在细胞中增殖效价的高低及最终疫苗生产的质量与对动物免疫效果密切相关[4]。兔体定型热反应方法作为一种检测猪瘟疫苗效价的传统方法，但受家兔个体差异因素的影响，且操作繁琐、耗时。半数细胞培养物感染量(TCID50)作为一种测定CSFV增殖滴度的方法较费时费力且受个人主观判断的影响[5]，因此，亟需快速、准确测定CSFV增殖滴度动态的方法。

本研究拟建立一种快速、敏感、特异的检测CSFV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，分析CSFV在PK-15细胞上清中的增殖动态，同时测定上清中的TCID50，并进行比较，以便为研究快速检测猪瘟疫苗效价及CSFV体外增殖规律等提供有效的理论依据。同时，通过该方法对CSFV在细胞上清中的增殖动态进行实时监测来达到优化接毒剂量、培养条件及CSFV最佳收获时间的目的，且省时省力，为生产出优质的CSFV疫苗及CSFV增殖机制的研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 病毒和细胞系 猪肾细胞(PK-15)、CSFV-Shimen(105.2TCID50/mL)，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和猪圆环病毒2型(PCV2)，均由河南省农科院动物免疫学实验室保存。

1.2 主要仪器与试剂 凝胶成像仪、荧光定量PCR仪、核酸蛋白检测仪等分别购自Bio-Rad公司和ABI公司；感受态大肠杆菌DH5α、pMD-18T载体、SYBR Green-I Premix ExTaqTM荧光PCR试剂、RNA酶抑制剂、病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒及DNA分子量Marker，均购自TaKaRa公司；DMEM培养基，胎牛血清，购自Hyclone公司；胰蛋白酶，购自Solarbio公司；琼脂糖，购自Invitrogen公司；引物合成及核酸测序工作由TaKaRa公司完成。

1.3 引物设计 据GenBank公布的CSFV Shimen毒株NS5A基因序列，用Primer 5.0引物设计软件设计引物，其序列如下：上游引物: P1：5′-GCAGAAGCCCACCTC-GAGAT -3′；下游引物: P2：5′-TACACCGGTTCCTCCACTCC-3′，预期扩增产物片段长度149 bp。

1.4 病毒RNA的提取及cDNA的合成 病毒 RNA提取参照试剂盒说明书进行，反转录 cDNA 的合成按照反转录酶 M-MLV 说明书进行，反转录后的cDNA置于﹣20 ℃保存备用。

1.5 标准品的制备 将CSFVNS5A片段与pMD18-T的连接产物加至DH5α感受态细胞，挑单个菌落纯培养后提质粒，经PCR鉴定后进一步测序分析，用NanoDrop 2000测定阳性质粒质量浓度，然后代入此公式Y (拷贝/μL)= [DNA 浓度X (g/μL) /DNA 长度(bp)×660]×6.02×1023，计算浓度后即为标品。

1.6 荧光定量PCR反应的建立和优化 用TaKaRa PremixExTaq试剂结合构建的阳性重组质粒，初步优化引物浓度及退火温度等反应条件。

1.7 标准曲线的建立 将标准品用灭菌三蒸水10倍倍比稀释后作为模板，采用建立的荧光定量PCR方法进行标准曲线和熔解曲线的绘制。

1.8 荧光定量PCR检测方法的评价

1.8.1 敏感性试验 按照1.6确定的反应体系，将10倍梯度稀释的标准品为模板，进行荧光定量PCR反应，该反应检出的最低模板浓度即为该方法的灵敏度。

1.8.2 特异性试验 在相同的条件下，对PCV2、BVDV提取核酸，同时设阴性对照为正常PK-15细胞混悬液，阳性对照为CSFV质粒标准品。上述样品按照1.6确定的反应体系进行荧光定量PCR 检测，确定该方法的特异性。

1.8.3 重复性试验 批间重复性试验：用所建立的方法对60 h、48 h、36 h三个不同时间点收集的CSFV细胞上清进行3次重复测定，采用同样的荧光定量PCR反应条件进行3次独立的试验，每次试验间隔3 d；批内重复性试验：对60 h、48 h、36 h三个不同时间点收集的CSFV细胞上清，在同一试验中的同一反应板上，采用同一反应条件对每个样品进行3次荧光定量PCR检测。

1.9 荧光定量PCR和TCID50体外增殖滴度测定比较

1.9.1 PK-15细胞培养及增殖CSFV 将PK-15细胞按照常规细胞培养方法培养成单层后，弃细胞生长液，按培养液体积的10% 接种CSFV Shimen(105.2TCID50/mL)，置37 ℃ CO2培养箱吸附90 min 后，补加5 mL 2%维持液后继续培养增殖病毒。

1.9.2 病毒液收集 按1.9.1陈述的方法用CSFV感染PK-15细胞，分别在感染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h收集病毒上清，12 000 r /min 离心5 min后用于病毒核酸提取。

1.9.3 病毒滴度的测定 对1.9.2不同时间收集的病毒上清液同时进行TCID50测定，根据3次重复的结果，计算平均值，并根据平均值绘制病毒的体外增殖曲线。

2 结果

2.1 标准品的制备 采用紫外分光光度计测定鉴定正确的阳性质粒(图1)核酸浓度，将DNA 拷贝数经公式换算为1×1010拷贝/μL，并进行10倍倍比稀释，将1×108拷贝/μL～1×101拷贝/μL的阳性质粒作为标准品。

图1 阳性质粒鉴定结果
M:DL-2 000 DNA Marker ； 1:NS5A阳性质粒 ； 2:阴性对照

2.2 荧光定量PCR反应条件的建立及优化 经相关试验优化后，确定最佳反应体系为20 μL: 模板1.0 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，SYBR Premix ExTaq10 μL，补充灭菌三蒸水至20 μL。反应程序为：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s，40个循环，最后制作熔解曲线。

2.3 标准曲线的建立 荧光定量PCR反应结束后，生成标准曲线如图2所示，熔解曲线如图3所示，其中标准曲线的斜率是3.173，截距是34.377，纵坐标y轴为获得的Ct值，横坐标x轴为对应的标准品拷贝数的对数。由图2可以看出，在较广的范围内(1.0×101～1.0×108拷贝/μL)有很好的线性关系，相关系数R2=0.999 9。熔解曲线分析结果表明，在80.0 ℃有一个拟合度非常好的单一峰，表明此引物是特异的，没有引物二聚体或非特异性扩增的出现(见封二彩版图3)。

图3 荧光定量Real-time PCR熔解曲线

2.4 敏感性试验 以10倍系列稀释的标准品

图2 荧光定量Real-time PCR标准曲线

(1×101～107拷贝/μL)为模板，进行荧光定量PCR扩增，结果表明，101拷贝/μL的cDNA仍能得到特异性扩增，在101～107拷贝/μL线性范围内有良好的扩增曲线(图4)(101拷贝/μL检测到的信号Ct值为30.91)。

图4 荧光定量Real-time PCR的敏感性

2.5 特异性试验 从封二彩版图5可以看出，只有CSFV阳性标准品有明显的特异性扩增曲线，BVDV和PCV2和阴性对照检测结果均为阴性，结果表明，本文建立的方法具有较好的特异性。

图5 荧光定量Real-time PCR的特异性

2.6 重复性试验 对3个样品批内和批间重复性试验的结果进行统计学分析，见表1和2。从表1可以看出，3个样品的批内重复的变异系数分别为0.90%，0.54%，0.70%，均小于1%；由表2可见，批间重复的变异系数分别为1.81%，1.1%，1.20%，均小于 2%；批内、批间重复性试验变异系数均小于2%。

表1 荧光定量 PCR 批内重复性

表2 荧光定量 PCR 批间重复性

2.7 荧光定量PCR和TCID50对CSFV细胞上清增殖滴度测定结果的相关性分析 取不同时间接毒后样品，对其分别进行荧光定量PCR和TCID50测定，并根据测定结果绘制曲线，见图6和7。由图6可以看出，8个不同时间点收集的CSFV细胞上清液中的病毒含量从接毒后12 h到60 h随着培养时间的延长病毒拷贝数几乎呈指数增长，并在60 h(103.7TCID50/mL)时病毒拷贝数达到高峰，随后呈下降趋势；病毒滴度的变化从接毒后12 h(101.5TCID50/mL)开始到48 h随着培养时间的延长而增加，并在48 h(104.2TCID50/mL)时达到高峰，随后逐渐开始下降，综合图6和7可以看出，虽然病毒滴度的测定结果与荧光定量RT-PCR结果在峰值上出现差异，但总体趋势是一致的，都是先上升后下降。

图6 CSFV石门毒株在PK-15细胞上清中的增殖曲线

图7 CSFV石门毒株在PK-15细胞上清中TCID50的变化

3 讨论

目前，弱毒疫苗免疫仍是控制猪瘟、减少经济损失的有效措施。CSFV细胞弱毒苗的病毒效价与疫苗的质量密切相关，因此，在疫苗生产过程中，最佳的病毒收获时间的确定是至关重要的，因此，掌握CSFV的增殖规律和收获时间是生产优质疫苗的前提。实时荧光定量PCR技术具有高敏感性、高特异性及操作简单等优点，广泛应用于病原体检测、基因表达研究和转基因产品检测等诸多领域[6-8]。本研究建立检测猪瘟病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，在1×108～1×101拷贝/μL范围内具有良好的线性关系，其敏感性达到101拷贝/μL，与王淑娟等[9]建立的方法(最低检出量为10拷贝/μL)结果一致。重复性较好，批间、批内变异系数均小于2%，且不与其他病毒发生交叉反应。此外该方法比常规方法相比，因其不需要电泳等对产物进行后期处理，节省了一半的时间，其敏感性比常规的RT-PCR高约100倍[10]。

荧光定量PCR技术应用于CSFV 检测，国内外已有报道。范斌等[11]从5′非编码区设计引物对猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量进行了检测，陈锴等[12]从基因组3′非编码区设计引物建立了荧光定量PCR对猪瘟兔化弱毒疫苗效价进行检验，结果表明，荧光定量PCR与家兔热反应测定结果存在良好的相关性，可以用于猪瘟疫苗半成品中HCLV定量检测。牛金鹏等[13]从5′非编码区设计引物建立了SYBR荧光定量PCR方法分析猪瘟石门强毒在急性感染期死亡猪体内的分布情况。本研究对CSFV石门毒株体外复制动态的研究首次采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，对不同接毒时间的PK-15细胞上清进行检测，根据测得的拷贝数，绘制CSFV在PK-15细胞上的生长曲线，并与采用TCID50方法测得的数据绘制的动态曲线进行比较。为了保证数据的准确性，每个时间点取3个重复样本，同时又进行了3次独立的重复试验，取最终的平均值绘制细胞上清中CSFV增殖动态曲线。荧光定量PCR方法与TCID50检测结果基本一致，荧光定量PCR方法测定的峰值与TCID50方法的峰值相比，推后了12 h，可能是由于TCID50方法测定的是活病毒粒子效价，而荧光定量PCR方法不同于TCID50方法，其检测的是病毒核酸的含量，其中即含有感染性的活病毒核酸、有抗原性和免疫原性但无感染性的失活病毒核酸以及尚未完成病毒粒子装配的核酸。本研究建立的荧光定量PCR检测方法具有很实用的应用价值，虽然失去了感染能力，但其具有抗原性和免疫原性，可作为有效抗原成分存在于疫苗中。应用两种方法测得的CSFV的增殖曲线有一定的平行关系，但由于荧光定量PCR方法比TCID50方法更快速、敏感，更适用于生产过程中对CSFV增殖滴度的实时快速测定。徐兴然等[14]采用间接免疫荧光染色检测病毒抗原、Real-time PCR检测病毒基因组RNA的增殖水平及病毒感染TCID50测定技术研究了CSFV在细胞上的增殖特点，本研究的结果与其结果一致，均呈现先上升后下降的趋势。王遵宝等[15]用间接免疫荧光染色检测病毒抗原、Real-time PCR及兔体定型热法对猪瘟兔化弱毒(ST细胞毒)进行了检测，结果表明，可用Real-time PCR法替代传统的兔体反应热法进行猪瘟活疫苗检测。

依据荧光定量PCR方法测定的CSFV增殖动态，精确分析CSFV在细胞上清中的增殖动力学规律，可以确定在PK-15细胞上最佳收毒时间，也为CSFV在PK-15细胞中的增殖动态提供了基础数据，同时为保质保量的猪瘟疫苗的生产提供了一定的科学依据。该检测方法灵敏、特异、快速的检测优点，为生产过程中的大规模增殖CSFV时实时监控病毒滴度等提供了一种有效手段，同时也为CSFV感染机制的研究、抗CSFV药物的研制等提供了一定的帮助。