抗病毒颗粒对人工感染鸡传染性支气管炎的临床疗效试验

柴小敏，孙 娜，晏永新，孙耀贵，李宏全

(1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801 ； 2.山西优势肉用家畜高效安全生产协同创新中心，山西太谷030801)

鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病，是危害养禽业的重要疫病之一。IB的频繁发生，加之可运用在临床防治IB的药物甚少，给养禽业带来巨大经济损失[1]。目前防治IB主要措施仍是接种疫苗，但由于IBV血清型多，变异快，疫苗难以交叉保护，使用不当还会导致IBV基因重组，从而不断产生新的基因型，故依靠疫苗来防治IB效果不甚理想[2]。因此，研制新型抗病毒的药物成了必然趋向。

大量研究证实，多种中药成分有抗病毒、抑菌和增强机体免疫力的作用。本实验室前期筛选了多种具有抗病毒作用的天然化合物，确定甘草酸二钾、苦参碱、丹参酮ⅡA磺酸纳、茶皂素、绿原酸和黄芩苷具有抗PRRSV的作用[3-4]；苦参碱、黄芩苷对PCV2有抗病毒活性[5]；甘草酸二钾、丹参酮ⅡA磺酸纳对MDV的抑制作用显著[6]。在此基础上，本试验根据组方原理，并结合现代中药生产技术，研制出由板蓝根、连翘、石膏、地黄、郁金和知母等组成的抗病毒颗粒，方中板蓝根为君药，清热解毒，具有良好的抗病毒功效[7]，连翘抗菌、抗病毒[8]，石膏解肌热、清肺火[9]，地黄滋阴凉血，郁金活血止痛、行气解郁，知母清热泻火、止咳除烦[9]，诸药合用具有凉血解毒、清热祛湿和止咳平喘的功效。本试验旨在评价抗病毒颗粒对IB的药效，并对其抗病毒机制进行初探，以确定用药剂量及后续机制研究。

1 材料与方法

1.1 病毒及试验动物 鸡传染性支气管炎病毒(M41株)，批号：AV1511，购自中国兽医药品监察所。360只1日龄伊莎褐健康鸡，购自山西康牧有限公司。

1.2 试验药物 抗病毒颗粒，试生产于亳州市乾元动物药业有限责任公司。规格：每1 g相当于原生药1.2 g；100 g/袋。生产批号：20160801。麻杏石甘散，江西省特邦动物药业有限公司生产，产品批准文号：兽字号(2012)140345174，生产批号：20170507，规格为 500 g/袋。

1.3 主要试剂 TRIzol总RNA提取试剂盒，购自Invitrogen公司；反转录试剂盒，购自Biotool公司；胶回收试剂盒(E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit)、质粒提取试剂盒(E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit)，均购自美国Omega公司；T5 Zero载体(pEASY®-T5 Zero Cloning kit)，购自北京全式金生物技术有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix(Low ROX)，购自Biotool公司；2×TaqPCR Master Mix和DNA Marker，均购自北京中科瑞泰生物科技有限公司。

1.4 IBV种毒复壮与鸡胚半数感染量(EID50)的测定 将IBV种毒冻干粉用生理盐水1∶10稀释，加入50 μL青霉素和链霉素混合液，4 ℃作用6 h，按0.2 mL/胚的剂量经尿囊腔接种于SPF鸡胚(9日龄)，37 ℃培养48 h后，无菌收集鸡胚尿囊液，1 000 r/min离心20 min。吸取上清液，置于-20 ℃保存。试验用的毒种是IBV盲传第3代病毒，其EID50经测定为10-4.27/0.2 mL。

1.5 试验设计 选取360只8日龄雏鸡，随机分为6组，分别为A组(抗病毒颗粒高剂量组)、B组(抗病毒颗粒中剂量组)、C组(抗病毒颗粒低剂量组)、D组(阳性药物对照组)、E组(空白对照组)、F组(病毒对照组)，每组60只，将每组分为a、b两个小组，每小组30只。其中a组雏鸡用于临床疗效观察和平均增重测定，b组雏鸡用于感染IBV后不同时间点免疫器官指数、靶器官病毒拷贝数及气管中IFN-β表达量的测定及病理组织学观察。分组见表1。

表1 试验设计

1.6 各药物组临床疗效观察及指标测定 试验期间，观察a组雏鸡的精神、饮食、行为等情况。试验结束时，统计各雏鸡的痊愈数、有效数和死亡数，计算痊愈率、有效率、死亡率、总有效率，综合评价抗病毒颗粒的临床疗效。

1.7 各试验组雏鸡平均增重 试验开始和结束时，取a组中每个重复的所有雏鸡，以重复为单位称重，计算各试验组的平均体重、平均增重和平均增重率。

1.8 各试验组雏鸡免疫器官指数 分别于雏鸡感染IBV第6、9、12天和15天时，从各试验组的b组中随机取6只雏鸡，每个重复2只，称取体重，剖检取其胸腺、脾脏、法氏囊称重，计算脏器指数。免疫器官指数=免疫器官重量(mg)/体重(g)。

1.9 各试验组雏鸡组织病理学观察 分别于雏鸡感染IBV第6、9、12天和15天时，从各试验组的b组中随机取6只雏鸡，每个重复2只，剖检，观察病理变化，取气管、肺部分组织在Bouin氏固定液中固定，分别进行脱水、透明和石蜡包埋，做5 μm厚切片，H.E.染色，显微镜下观察组织病理学变化。

1.10 各试验组雏鸡气管、支气管、肺脏中IBVN基因的拷贝数 分别于雏鸡感染IBV第6、9、12天和15天时，取各组雏鸡气管、支气管、肺脏冻存，参照Invitrogen TRIzol提取试剂盒说明书提取组织总RNA，按照反转录试剂盒对所提RNA反转录为cDNA，利用NCBI网站引物设计工具，根据IBVN基因保守序列设计引物，并制备重组质粒作为标准品，以10倍倍比稀释的重组质粒为模板，加入IBVN基因上下游引物，进行SYBR Green RT-PCR扩增，以各稀释度的起始模板量和其对应的Ct值制作标准曲线，按照qPCR反应体系及反应条件检测各组织中所含IBVN基因的拷贝数。

1.11 各试验组雏鸡气管中IFN-β的表达量 选取感染IBV第9天雏鸡各组气管冻存，参照Invitrogen TRIzol提取试剂盒说明书提取组织总RNA，按照反转录试剂盒对所提RNA反转录为cDNA，利用NCBI网站引物设计工具，根据β-actin基因、IFN-β基因保守序列设计引物，采用Comparative ΔΔCt法，对各样本IFN-β mRNA进行相对定量分析，计算RQ值(2-ΔΔCt)。

表2 引物序列及产物大小

1.12 试验数据的统计分析 本试验所有数据均采用EXCEL2010版和GraphPad PrismTM5软件(GraphPad Software，Inc.California，USA)进行处理与统计分析。采用One-way Anova来确定各组之间的差异性，所有数据均采用均值±标准误(Mean±SEM)表示。字母相同者，表示差异不显著(P>0.05)；字母不同者，表示差异显著(P<0.05)。

2 结果

2.1 雏鸡感染IBV后临床症状观察 采用104.27EID50IBV第3代鸡胚尿囊液，以0.2 mL/只的剂量滴鼻点眼感染雏鸡，感染48 h后，与E组相比，其他各试验组雏鸡均出现了IB典型临床症状，主要表现为扎堆、精神沉郁、食欲下降、咳嗽等症状。攻毒72 h后开始用药，通过用药后不同时间段的观察，发现各药物治疗组病鸡精神状态开始好转，食欲与E组无明显差异，咳嗽雏鸡数量明显减少，尤以A、B组症状减轻最为显著，D组次之，试验中后期A、B组雏鸡临床症状基本消失。结果表明，抗病毒颗粒对IB疗效确切。

2.2 各试验组临床疗效测定 与F组相比，各药物组总有效率、痊愈率均显著增高(P<0.05)，死亡率均显著降低(P<0.05)。与D组相比，A、B组总有效率均有增高趋势，但差异不显著(P>0.05)，痊愈率均显著增高(P<0.05)，C组总有效率、痊愈率均显著降低(P<0.05)，A、B组死亡率均显著降低(P<0.05)，C组死亡率显著增高(P<0.05)(见表3)。结果表明：A、B组对人工感染IB均有良好的治疗效果，考虑用药成本，推荐剂量以B组剂量为宜。

2.3 平均增重 与E组相比，试验结束时，F组的体重、平均增重和平均增重率均显著降低(P<0.05)。与F组相比，各用药组的体重、平均增重和平均增重率均显著增高(P<0.05)。与D组相比，A、B组的体重显著增高(P<0.05)，平均增重和平均增重率均差异不显著(P>0.05)，C组的体重、平均增重和平均增重率均显著降低(P<0.05)(见表4)。试验结果表明，A、B组对人工感染IB鸡的增重有较好的促进作用，考虑用药成本，推荐B组剂量为临床最佳使用剂量。

2.4 免疫器官指数 由图1可知，雏鸡感染IBV第6、9、12天和第15天时，与E组相比，F组的胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数均显著降低(P<0.05)。与F组相比，各用药组的胸腺指数、脾脏指数均有升高的趋势，但差异不显著(P>0.05)，在感染第12天和第15天时，A组的法氏囊指数均显著升高(P<0.05)。与D组相比，各用药组的胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数均无显著差异(P>0.05)。整体来看，A、B组的免疫器官指数升高的趋势较大。

表3 抗病毒颗粒对人工感染鸡传染性支气管炎的疗效

注：不同组中，用相同字母标注的数值表示差异性不显著(P>0.05)；不同字母标注的数值表示差异显著(P<0.05)；下同

表4 抗病毒颗粒对鸡体重的影响

图1 抗病毒颗粒对鸡免疫器官指数的影响

注：数据采用Mean±standard errors mean(SEM)的形式；不同的小写字母(a、b、c、d)表示各组之间差异显著(P<0.05)；下同

2.5 病理剖检和组织病理学观察 整体来看，在病毒感染的不同时间段，F组的器官病变程度均最严重，主要病变在气管、喉头、肺和胸腺。经用药治疗后，各用药组的病变均有不同程度的改善，其中，以A、B组的改善程度较为显著。

试验鸡气管组织病理学观察结果见中插彩版图2。如图所示，E组气管组织结构完整，无任何病理变化(见中插彩版图2a)。F组在感染后黏膜水肿，上皮细胞及气管纤毛严重脱落，可见固有层腺体细胞崩解、淋巴细胞和巨噬细胞增生，气管腔内有脱落的上皮细胞及渗出的红细胞和淋巴细胞(中插彩版图2b)。A、B组可明显观察到上皮细胞、腺体结构的再生，固有层浸润增生的炎性细胞显著减少，仅有少量的出血现象(中插彩版图2c、2d)。C组出现再生的上皮细胞，黏膜层开始形成不规则的黏液腺，仍可见气管腔内脱落的上皮细胞、渗出的淋巴细胞及红细胞(中插彩版图2e)。D组上皮细胞再生明显，腺细胞有逐渐形成腺体的趋向，一些上皮细胞已分化形成柱状，淋巴细胞浸润和出血现象明显减少(中插彩版图2f)。

图2 各组鸡气管组织病理学变化 (H.E.染色，400×)

试验鸡肺组织病理学观察结果见中插彩版图3。如图所示，E组的肺组织结构完整，无任何病理变化(见中插彩版图3a)。F组在感染后，肺内各级支气管明显扩张，支气管黏膜肿胀，固有层水肿、充血及出血，可见淋巴细胞和异嗜性粒细胞浸润，支气管腔内可见脱落的上皮细胞、红细胞及炎性渗出物(中插彩版图3b)。抗病毒颗粒各剂量组用药后均有不同程度的好转，A、B组改善最为显著，可见固有层、肺泡中炎性渗出和红细胞渗出明显减少，上皮细胞再生程度明显，肺泡分布均匀结构开始趋于完整(中插彩版图3c、3d、3e)。D组与A、B组效果无明显差异(中插彩版图3f)。

图3 各组鸡肺脏组织病理学变化 (H.E.染色，400×)

2.6 靶器官中IBVN基因拷贝数及IFN-β的表达 由图4可知，雏鸡感染IBV第6、9、12天和第15天时，与E组相比，F组气管、支气管、肺脏中IBVN基因的拷贝数均显著增高(P<0.05)。与F组相比，各用药组气管、支气管、肺脏中IBVN基因的拷贝数均显著降低(P<0.05)。与D组相比，各用药组气管、支气管、肺脏中IBVN基因的拷贝数均无显著差异(P>0.05)。在感染IBV第6天时，气管中A组IBVN基因的拷贝数显著低于C组(P<0.05)，在感染第12天时，支气管中A组IBVN基因的拷贝数显著低于C组(P<0.05)，在感染第9天时，肺脏中A组IBVN基因的拷贝数显著低于C组(P<0.05)，其他各组均差异不显著(P>0.05)。

各试验组均检测到IFN-β的表达。与E组相比，F组IFN-β的表达有上升趋势，但差异不显著(P>0.05)。与F组相比，A、B组能显著上调IFN-β的表达(P<0.05)，优于C、D组(P>0.05)。与D组相比，A组能显著上调IFN-β的表达(P<0.05)，其他各药物组相比，均无明显差异(P>0.05)。

图4 抗病毒颗粒对鸡气管、支气管、肺脏中IBVN基因拷贝数及气管中IFN-β表达量的影响

3 讨论

传统医学认为，IB是热毒入侵肺经所致，肺气不宣，则呼吸不畅导致咳喘，肺气清肃，肺失肃降，肺气则会上逆，同样造成咳喘，从而导致脾运化受阻，肝肾气血不足，最终咳喘加重。因此临证中通常选用清热解毒、理气宣肺和止咳化痰平喘的方法进行治疗[10]。本试验采用抗病毒颗粒，方中板蓝根、连翘、石膏、地黄、郁金和知母等诸药合用具有凉血解毒、清热祛湿和止咳平喘的功效。本试验结果显示：按8 g/L和4 g/L的剂量连续5 d通过饮水给予抗病毒颗粒，对人工感染IB鸡只治疗的总有效率分别为90.00%和86.67%，痊愈率分别为80.00%和76.67%，死亡率分别降低为10.00%和13.33%，说明抗病毒颗粒对人工感染IB有显著的治疗作用。

胸腺作为机体重要的淋巴器官，是T淋巴细胞增殖与分化的场所，对细胞免疫功能具有重要意义。脾脏是机体内最大的外周免疫器官，脾指数的增加可以诱导T淋巴细胞的增殖和B细胞抗体的分泌。法氏囊是禽类特有的免疫器官，发挥着免疫中枢的作用，为B细胞分化与成熟提供场所[11-12]。本试验结果显示：在雏鸡感染IBV第6 、9 、12天和第15天时，各用药组的胸腺指数、脾脏指数与F组相比，均有升高的趋势，但差异不显著(P>0.05)。在感染IBV第12天和第15天时，与F组相比，A组的法氏囊指数均显著升高(P<0.05)，其余各组的法氏囊指数均有升高的趋势，但差异不显著(P>0.05)。表明A、B组可以增加免疫器官指数，增强感染鸡机体免疫力。

IBV感染周期中，N蛋白的主要功能为包裹病毒基因组RNA形成核衣壳，且参与病毒RNA的转录、复制以及宿主细胞代谢的调控以促进病毒复制[13]。在感染的细胞中，N蛋白能够定位于细胞浆、细胞核以及核仁中，定位于核仁的N蛋白可能干扰宿主细胞的翻译以及细胞周期，并促进病毒RNA的翻译[14]。本试验结果显示：在雏鸡感染IBV第6 、9 、12天和第15天时，与F组相比，各用药组气管、支气管、肺脏中IBVN基因的拷贝数均显著降低(P<0.05)，与D组相比，抗病毒颗粒各剂量组各组织IBV N基因的拷贝数均无显著差异(P>0.05)。因此，抗病毒颗粒可能通过抑制N蛋白的表达，以抑制病毒在宿主细胞复制的多个关键点，最终抑制IBV在宿主细胞的复制。

干扰素是一类生物学活性广泛的细胞因子，其中Ⅰ型干扰素在机体天然免疫过程中具有重要作用，能够抑制病毒复制、肿瘤细胞生长及调节机体免疫力。病毒侵入机体后可被机体模式识别受体识别，激活机体抗病毒免疫应答，诱导Ⅰ型干扰素的产生，IFN-β属于Ⅰ型干扰素，在抗病毒感染中发挥重要的作用[15]。本试验结果显示：抗病毒颗粒可诱生IFN-β，且A、B组能显著上调IFN-β的表达，优于D组。

4 结论

抗病毒颗粒对IB具有显著的治疗作用，既可直接抑制IBVN基因复制，又可增强机体免疫器官指数、增加IFN-β表达，从而抑制病毒增殖。综合考虑用药成本和临床疗效，推荐按4 g/L的剂量在实际生产中应用。