动物性食品中阿维菌素类药物残留检测高效液相色谱法的优化

谭 梅， 李燕君，李 然，吴晓岚，岳秀英，吕晓华

(1.四川大学华西公共卫生学院 华西第四医院，四川成都610041 ； 2.四川省兽药监察所，四川成都610041)

阿维菌素类药物是目前应用最广泛的兽用驱虫药，包括爱普菌素、阿维菌素、多拉菌素、伊维菌素等品种。阿维菌素类药物虽然作用剂量小，但脂溶性较高，残留时间长，世界卫生组织将其列为高毒化合物[1]。目前动物性食品中阿维菌素类药物残留检测多采用酶联免疫吸附法[2-3]、免疫亲和色谱法[4]、高效液相色谱法[5-6]、超高液相色谱-串联质谱法[7-8]等方法，本试验对农业部1025号公告-5-2008动物性食品中阿维菌素类药物残留检测-酶联免疫吸附法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法中的高效液相色谱法进行优化，探索一种操作方便、耗时短且符合兽药残留试验技术规范要求的阿维菌素类药物残留检测方法。

1 材料与方法

1.1 样品 牛肝，购自四川省成都市武侯区玉林菜市场，经检测无阿维菌素类药物残留。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪(费尔伯恩精密仪器有限公司)，474荧光检测器(北京京科瑞达科技有限公司)，UNIVERSAL 32R型离心机(上海素尔生物科技有限公司)，HEIDOLPH LABOROTA 4000型旋转蒸发仪(北京康高特科技有限公司)，Bond Elut 200 mg/3 mL C18固相萃取柱(北京吉瑞森科技有限公司)。

1.2.2 标准物质和主要试剂 爱普菌素标准物质(纯度92%)、阿维菌素标准物质(纯度92%)、多拉菌素标准物质(纯度94%)、伊维菌素标准物质(纯度92%)，由中国农业大学动物医学院提供。色谱纯甲醇、乙腈，分析纯三氟乙酸酐、冰乙酸、三乙胺，1-N-甲基咪唑(纯度>99%)，由塞默飞世尔科技(中国)有限公司提供。衍生化试剂A液∶1-甲基咪唑-乙腈(1∶1，V/V)，衍生化试剂B液∶三氟乙酸酐-乙腈(1∶2，V/V)。

1.3 标准溶液配制 分别称取4种标准物质10 mg，置于100 mL容量瓶中溶于乙腈，定容至刻度线，分别配置成100 μg/mL标准贮备液。分别量取4种标准贮备液1 mL，置于100 mL容量瓶中用乙腈定容至刻度线，配制成1 μg/mL的混合标准工作液。

1.4 检测方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱：Waters symmetry C18 5 μm，250 mm×4.6 mm(内径)；流动相：乙腈+水(96∶4，V/V)；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；激发波长：365 nm；发射波长：475 nm；进样量：20 μL。

1.4.2 标准曲线绘制 准确量取混合标准工作液适量，按照样品提取液的衍生化程序衍生化，甲醇定容，配制成浓度为2、5、10、20、50、100 μg/L和200 μg/L标准溶液，上机测定，以各组分的色谱峰面积对浓度作线性回归，绘制定量标准曲线。

1.4.3 样品前处理 牛肝在室温下匀浆，准确称取5.0 g，置于50 mL离心管，加入8 mL乙腈，涡动0.5 min，2 000 r/min离心5 min。残留组织用8 mL乙腈重复提取1次。合并2次上清液于鸡心瓶在60 ℃水浴中旋转蒸干，4 mL乙腈-水-三乙胺(40∶60∶0.1,V/V)溶解残留物备用。先用4 mL乙腈、4 mL乙腈-水-三乙胺(40∶60∶0.1,V/V)活化和平衡C18 SPE柱，再将牛肝提取液上柱，待滤液将近流尽，用5 mL乙腈-水-三乙胺(40∶60∶0.1,V/V)洗涤C18 SPE柱，吹干，再用3 mL正己烷洗涤，吹干。用4 mL乙腈洗脱，收集所有流出液，氮气吹干。加入100 μL衍生化试剂A液，涡动0.5 min，加入150 μL衍生化试剂B液，涡动0.5 min，再加入50 μL冰乙酸和50 μL三乙胺密闭，于65 ℃衍生化反应30 min，加入甲醇定容至1.0 mL，0.45 μm针筒滤膜过滤，上机检测。

1.4.4 加标回收试验 牛肝匀浆中添加爱普菌素、阿维菌素、多拉菌素、伊维菌素混合标准工作液，添加后的终浓度为5 μg/kg、10 μg/kg和50 μg/kg。每批各浓度样品分别制备5份，共3批。肝匀浆添加混合标准工作液后，涡动0.5 min，静置15 min，按上述样品的前处理方法步骤测定各药物含量，分别计算批内变异系数和批间变异系数。

1.4.5 确定检测限 牛肝匀浆按照样品前处理步骤，上机测定噪音信号，计算平均值。信噪比≥3为检测限，信噪比≥10为定量限。

2 结果

2.1 阿维菌素类药物衍生化产物的保留时间 如图1所示，在上述色谱条件下，爱普菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的衍生化产物相应保留时间分别为10、12、15 min和20 min。

图1 10 μg/L阿维菌素类药物标准溶液色谱图

2.2 标准曲线 如表1和图2所示，标准溶液浓度在2～200 μg/L范围时，爱普菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的标准曲线线性关系良好，回归系数分别为0.999 2、0.999 5、0.999 4、0.999 4。

2.3 检测限和定量限 爱普菌素、阿维菌素、伊维菌素和多拉菌素的检测限均为2 μg/kg，定量限均为5 μg/kg。

图2 阿维菌素类药物标准曲线

表1 标准曲线线性回归方程

2.4 加标回收试验结果 如表2所示，爱普菌素、阿维菌素、伊维菌素和多拉菌素的加标回收率在83%～93%，批内变异系数均<14%，批间变异系数<11%。

表2 加标回收试验结果

3 讨论

阿维菌素类药物是由阿维链霉菌产生的新型大环内酯类抗寄生虫药物，具有杀虫活性强和虫谱广的特点[1,9]，广泛应用于农牧业。研究发现，阿维菌素类药物正常使用残留于环境或过度使用可引起禽类、水生生物和哺乳动物等多种动物神经毒性、免疫毒性、生殖毒性等，甚至导致死亡[10]。含有阿维菌素类药物的动物性食品对人类健康亦存在威胁[11]，因此阿维菌素类药物残留的检测方法备受关注。目前动物性食品阿维菌素类药物残留的检测方法中，酶联免疫吸附法检测限低，但重复性差，应用范围受限；免疫亲和色谱技术精密度高，可快速自动分析，但成本昂贵；超高液相色谱-串联质谱法是确证方法，但其仪器昂贵，难以推广；高效液相色谱法应用最为广泛，且灵敏度高、可靠性强[12-14]，但农业部1025号公告-5-2008标准中的高效液相色谱法耗时长，操作复杂。

本文对农业部1025号公告-5-2008标准中的高效液相色谱法进行优化，改进了样品提取后储存条件、净化条件和衍生化条件，如表3所示。优化法试验结果表明，爱普菌素、阿维菌素、伊维菌素和多拉菌素等4种阿维菌素类药物的保留时间合理；检测限2 μg/kg，定量限5 μg/kg；在2～200 μg/L的浓度范围内，标准曲线线性良好，相关系数均大于0.999 2；加标回收率在83%～93%，批内变异系数小于14%，批间变异系数小于11%。与农业部1025号公告-5-2008标准中的高效液相色谱法比较，其准确度和精密度较好，如表4所示。

表3 优化法与标准法的试验条件比较

表4 优化法与标准法的灵敏度、准确度和精密度比较

3.1 样品选择 阿维菌素类药物对牛的线虫和疥螨等驱杀效果好，具有广谱、高效和用量小等优点。但由于超量用药、盲目用药和不执行休药期规定等滥用阿维菌素类药物的情况，对牛肉及制品的食品安全性造成影响，有研究表明，频繁用药和亚剂量用药可能是耐药性产生的两大主要因素[15]。阿维菌素类药物的休药期，畜禽类中以牛最长(35 d)[16]，肝脏是阿维菌素类药物的主要代谢部位[17]，我国规定牛肝中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的最高残留限量为100 μg/kg[18]。农业部1025号公告-5-2008标准适用于牛肝、牛肌肉等，故本文选用牛肝作为优化阿维菌素类药物残留检测高效液相色谱法的试验样品。

3.2 样品提取后储存条件的优化 样品提取后用乙腈-水-三乙胺储存，增加样品稳定性，储存时间更长，并经过反复试验确定乙腈-水-三乙胺的比例为乙腈∶水∶三乙胺=40∶60∶0.1(V/V)，与农业部1025号公告的-5-2008标准相比，不仅增加样品稳定性和储存时间，也减少了色谱图拖尾现象。

3.3 净化条件的优化 农业部1025号公告的-5-2008标准联用碱性氧化铝柱和C18 SPE柱对样品净化，耗时长，成本高。有研究表明，C18 SPE柱能保证药物保留效率，缩短过柱时间[5]。本文采用C18 SPE柱，并对C18 SPE柱的过柱溶液进一步优化，增加采用乙腈-水-三乙胺(40∶60∶0.1,V/V)活化和平衡C18 SPE柱，洗脱过程增加乙腈-水-三乙胺(40∶60∶0.1,V/V)和正己烷。结果提示，净化条件优化减少了过碱性氧化铝柱、50 ℃减压浓缩至干及再溶解的步骤，节约成本和时间，而且样品净化程度提高，准确度和精密度也较好。

3.4 衍生化条件的优化 农业部1025号公告的-5-2008标准，仅采用1-甲基咪唑-乙腈(1∶1，V/V)和三氟乙酸酐-乙腈(1∶2，V/V)进行衍生化，用乙腈定容，96 ℃条件下衍生反应100 min。有研究表明，当衍生化时间为100 min时，阿维菌素类药物的衍生化产物反而略微减少[5]。综合考虑反应效率和试验时间，本文增加冰乙酸和三乙胺两种衍生试剂，65 ℃条件下衍生反应30 min，不仅增加了衍生化效率，也缩短了试验时长。产生的衍生化产物加入甲醇，使其更加稳定。有报道显示，动物类食物中阿维菌素类药物残留检测的高效液相色谱法中，衍生化试剂增加冰乙酸和三乙胺，用甲醇定容，可使衍生化效率更高且衍生物更加稳定，色谱峰响应时间一致性好[19]，与本文结果相似。

综上，优化法符合兽药残留试验技术规范的要求[20]，准确度和精密度较好，检测时间和成本低于标准法，可用于动物性食品中阿维菌素类药物残留的检测。