鸡皮脂和肾脏中替米考星残留HPLC检测方法的建立

刘联盟，梁 军，吕凤霞，李灵娟，冯文丽

(1.河南牧翔动物药业有限公司，河南郑州451162 ； 2.郑州市兽药饲料监察所，河南郑州450000)

替米考星是一种动物专用大环内酯类(MALs)抗生素，抗菌谱较广，对革兰阳性菌和部分阴性菌、支原体等均有效，具有较强的抗菌活性，主要用于牛、奶牛、山羊、绵羊、猪、鸡等动物由敏感菌引起的感染性疾病，特别是畜禽呼吸道疾病，如猪放线杆菌性胸膜肺炎、牛溶血性及多杀性巴氏杆菌病和鸡支原体病，同时对奶牛乳房炎主要菌系具有良好的抗菌作用[1]。不合理的使用药物不仅对动物本身造成一定的影响，药物在动物性食品中的残留还会进一步对人类的健康造成潜在的威胁。为加强兽药残留监控工作，保证动物性食品卫生安全，维护人体健康，我国农业部于2002年发布了第235号公告[2]，对动物性食品中兽药最高残留限量和残留标示物进行了规定，其中替米考星的组织残留标示物为其原型，鸡肌肉、皮脂、肝脏和肾脏组织中替米考星最高残留分别为75、75、1 000 μg/kg和250 μg/kg。

农业部第1025号公告[3]中，发布了动物性食品中替米考星残留检测高效液相色谱法，该方法仅适用于猪肌肉和肝脏、鸡肌肉和肝脏组织中替米考星的残留检测，而鸡可食性组织中皮脂和肾脏组织中替米考星残留检测方法未发布国家标准，且目前国内未发现鸡皮脂和肾脏组织中替米考星残留检测方法的报道，其他动物性食品中替米考星残留的测定方法主要有高效液相色谱法[4-7]、质谱法[8-10]等，其中前者仪器操作简单、普及面广，是最常用的替米考星检测方法。为完善健全鸡可食性组织中替米考星残留检测方法，便于兽药残留监控，保证食品卫生安全，本试验建立了鸡肾脏和皮脂组织中替米考星残留的检测方法。

1 材料与方法

1.1 设备与试剂

1.1.1 主要设备 Agilent1200高效液相色谱仪，配VWD紫外检测器，Agilent公司；N-EVAP34氮吹仪，Organomation Assciates公司；3-30k型高速冷冻离心机，Sigma公司；XP205电子分析天平，感量0.00 001 g，METTLER TOLEDO公司。

1.1.2 主要试剂 替米考星对照品，含量95.0%，批号C17582000，Dr. Ehrenstorfer公司；MCX SPE固相萃取柱，6 CC(150 mg)，Waters公司；甲醇、乙腈、四氢呋喃均为色谱纯，Merck公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要试液配制

1.2.1 二丁胺磷酸缓冲液 取10%磷酸溶液700 mL，缓缓加入168 mL二丁胺，边加边搅拌。冷却至室温，用85%磷酸调pH值至2.5，加水稀释至1 000 mL。注意该试液变成棕色时不能使用。

1.2.2 pH值5.0磷酸盐缓冲液 量取0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液一定量，用氢氧化钠试液调节pH值至5.0，即得。

1.2.3 洗脱液 量取5 mL氨水，加至95 mL甲醇中，混匀。

1.2.4 流动相 分别量取115 mL乙腈、55 mL四氢呋喃、25 mL二丁胺磷酸缓冲液，依次加入805 mL水中，稀释至1 000 mL，混合均匀，0.2 μm滤膜过滤。配制前各组分要真空脱气。使用时密封，以防止流动相中的有机溶剂挥发。

1.2.5 替米考星储备液 精密称取替米考星对照品约21.05 mg置于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得200 μg/mL的替米考星储备液。4 ℃下避光保存。

1.2.6 替米考星工作液 精密量取200 μg/mL替米考星储备液5 mL置于100 mL棕色容量瓶中，用流动相稀释并定容。4 ℃下避光保存。

1.3 色谱工作条件 流动相：乙腈-四氢呋喃-1 mol/L二丁胺磷酸缓冲液-水(115/55/25/805，v/v/v)；色谱柱：Agilent HC-C18(2)(250×4.6 mm，5 μm)；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：50 μL。

1.4 标曲建立 量取适量10 μg/mL替米考星标准工作液于容量瓶中，用流动相稀释并定容，制成浓度为0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL的系列标准工作液，依次进样，以替米考星浓度为横坐标，以其峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求出回归方程。现配现用。

1.5 样品前处理

1.5.1 提取 称取(5.0 ± 0.05)g试样于50 mL离心管中，加8 mL乙腈，涡动混匀，中速振荡30 min，9 000 r/min离心10 min，取上清液(其中皮脂样品乙腈、脂肪分层，取全部乙腈，下同)于50 mL离心管中，组织残渣中再加5 mL乙腈，超声破碎，涡动混匀，中速振荡30 min，9 000 r/ min离心10 min，合并两次上清液。将上清液50 ℃水浴氮气吹至1～2 mL，依次加入8 mL流动相、1 mL正己烷，涡旋5 min，9 000 r/min离心10 min，取全部中间清液记为A液。残渣加3 mL pH值5.0磷酸盐缓冲液，涡旋5 min，9 000 r/min离心10 min，取全部中间清液记为B液。

1.5.2 净化 取MCX(6 CC/150 mg)小柱，依次用10 mL甲醇、2 mL pH值5.0磷酸盐缓冲液平衡，依次将上述A液和B液全部过柱。再用10 mL水和5 mL甲醇洗涤，抽真空干燥1 min，用4 mL洗脱液洗脱。收集洗脱液，50 ℃水浴中氮气吹干。加1 mL流动相，涡动2 min溶解，过滤，供HPLC分析。固相萃取过柱、洗涤液和洗脱液流速均不超过1 mL/min。

1.6 灵敏度 取鸡空白皮脂和肾脏组织试样添加适量浓度的替米考星标准工作液，各5个平行，按样品前处理方法处理后测定。取信噪比S/N≥3时的浓度为检测限(LOD)，信噪比S/N≥10时，且准确度与精密度符合要求的浓度为定量限(LOQ)。

1.7 准确度和精密度 皮脂组织添加替米考星在35、75 μg/kg和150 μg/kg三个浓度水平，肾脏组织添加替米考星在50、250 μg/kg和500 μg/kg三个浓度水平，进行准确度和精密度考察试验，按样品前处理方法处理后测定。每批每种组织的各个浓度设5个平行样品，连续3 d，共作3个批次，以此分别计算批内和批间变异系数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线 替米考星标准溶液在0.1～5.0 μg/mL浓度范围内，药物浓度与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=76.188X+3.576 6 (R2=0.999 9)，绘制的标准曲线，见图1。

图1 替米考星线性关系

2.2 色谱行为 替米考星对照品、皮脂及肾脏空白组织、皮脂及肾脏空白组织分别添加替米考星的色谱图见图2。在本试验建立的色谱条件下，待测组分替米考星与溶剂峰及组织中其他基质组分能够完全分开，不干扰结果的测定。

2.3 结果计算 鸡皮脂和肾脏中替米考星的残留量计算采用标准曲线的回归方程进行计算，在试样测定前应使用替米考星标准工作液建立标准曲线。若测定试样溶液中替米考星浓度超出标准曲线浓度范围，应将样品浓度定量稀释或浓度。

图2 鸡皮脂和肾脏中添加替米考星色谱图

a:0.5 μg/mL标准溶液 ； b:皮脂空白样品 ； c:75 μg/kg皮脂添加样品 ； d:肾脏空白样品 ； e:125 μg/kg肾脏添加样品

2.3.1 残留量的计算 替米考星组织中残留的量X，按下式计算：

式中：C为试样溶液中对应的替米考星的浓度(μg/mL)；V为溶解残余物所用流动相的体积(mL)；m为试样的重量(g)。

2.3.2 回收率的计算 替米考星添加回收率，按下式计算：

式中：X实测为空白组织添加替米考星的实测残留量；X添加为空白组织实际添加替米考星。

2.4 灵敏度 由鸡皮脂和肾脏组织中添加替米考星考察得，本方法替米考星在鸡皮脂组织中的检测限为20 μg/kg，定量限为35 μg/kg；在鸡肾脏组织中的检测限为30 μg/kg，定量限为50 μg/kg。

2.5 准确度和精密度 样品添加回收率测定结果见表1，批内及批间精密度测定结果见表2。鸡皮脂组织的回收率在75%～98%之间，批内与批间变异系数均小于10%；鸡肾脏组织的回收率在71%～97%之间，批内变异系数小于11%，批间变异系数小于10%。表明该方法准确度、精密度高，重复性好。

表1 鸡皮脂和肾脏中添加替米考星回收率 (%，n=5)

表2 鸡皮脂和肾脏中添加替米考星批内与批间变异系数

3 讨论

3.1 色谱条件 替米考星是MALs类抗生素的一种，有较强的紫外吸收，HPLC法配紫外检测器是对其进行残留检测的主要方法。反相色谱柱是目前MALs类药物检测中最常用的色谱柱，其具有保留性强、分离效果好、适应范围广等特点。在其他条件下，反相色谱柱随柱温升高分离性能有所下降，为保持系统稳定性，选择高室温5 ℃即30 ℃作为柱温箱温度。研究比较了相关文献[3,11-13]中流动相配比，考察目标色谱峰与杂质峰分离度、保留时间、峰宽、峰对称性，发现《中国兽药典》中流动相组成及比例最优。

3.2 样品前处理 组织样品中药物的提取溶剂一般遵循相似相溶原理。替米考星属于MALs类，为极性、弱碱性化合物，易溶于乙腈、甲醇等有机溶剂和磷酸盐缓冲溶液[8]，国内外报道关于组织中MALs的提取溶剂主要有乙腈[9,13]、乙腈-缓冲盐溶液[3,4-6,12]，另有甲酸水-乙腈溶液[10]、甲醇[7]等。本试验比较甲醇、乙腈和磷酸盐3种提取液提取效果后发现：甲醇提取液萃取后杂质较多且难以浓缩；磷酸盐缓冲液提取后难以浓缩、皮脂组织漂浮不易离心沉淀除杂，杂质干扰较多；乙腈可沉淀蛋白，离心后与脂肪可分层，提取的样品杂质较少。最终选择乙腈作为样品提取剂。

提取液在较低温度(50 ℃)浓缩，可防止药物被破坏，浓缩至1～2 mL，可节省浓缩时间，又可避免完全吹干后药物吸附、固化于离心管壁降低回收率。浓缩后的提取液用8 mL流动相和1 mL正己烷涡旋溶解，减少药物在离心管中残留损失，有利于回收率提高。样品提取过程中加入无水硫酸钠可去除组织中的游离水，促使有机相和水相分离，通过对比试验得知添加无水硫酸钠并不能明显增加药物的回收率。

常用于MALs类净化的固相萃取柱有普通离子交换SPE柱、HLB柱、MCX柱等。普通离子交换SPE柱利用静电吸引原理进行萃取，对杂质去除率较高但回收率较低。亲水亲脂平衡的HLB柱吸附剂的表面积增大2～3倍，增加了极性物质保留的能力，但缺点亦是选择性较差。混合型强阳离子交换MCX柱提供了离子交换和反相保留双重模式，对碱性化合物具有高选择性，可耐受有机溶剂，克服了传统硅胶基质混合型吸附剂的局限性，保留效果、选择性能大大提升。因替米考星为极性、弱碱性化合物，故选择MCX柱作为净化的固相萃取柱。选择了6 cc(150 mg)和3 cc(60 mg)两种规格MCX柱进行比较，结果表明6 cc(150 mg)的MCX柱去杂质效果好、回收率高。

MCX柱依次用10 mL甲醇、2 mL pH值5.0磷酸盐缓冲液平衡，A液上样后将B液作淋洗液可减少药物在离心管中的损耗，同时使离子化药物与吸附剂结合更加牢固且去除部分酸性杂质；再用10 mL水和5 mL甲醇淋洗进一步去除盐类和部分中性杂质。比较了3 mL、5 mL、8 mL甲醇淋洗效果及药物回收率，发现8 mL甲醇淋洗杂质去除率最好，但药物回收率低于5 mL甲醇淋洗，综合考虑选择5 mL甲醇淋洗。比较了不同剂量的5%氨化甲醇、10%氨化甲醇、3%氨化乙腈、5%氨化乙腈、10%氨化乙腈对药物的洗脱效果，最终选择4 mL的 5%氨化甲醇作洗脱液，洗脱效果好且甲醇用量少，减少环境污染。

本试验建立了鸡皮脂和肾脏组织中替米考星残留量的HPLC测定方法，替米考星在鸡皮脂组织中的检测限和定量限分别为20 μg/kg和35 μg/kg，在鸡肾脏组织中的检测限和定量限分别为30 μg/kg和50 μg/kg，能够满足我国农业部第235号公告中对替米考星在鸡皮脂和肾脏组织中最高残留限量残留检测需求，并通过了四川省兽药监察所和安徽省兽药饲料监察所的复核验证，该方法简单、准确、灵敏，适用于鸡皮脂和肾脏组织中替米考星的残留检测。