猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及其分子流行病学调查

杨 斌，黄红亮，吴玉全，廖翠银，方倪冉，王志伟，陈瑞爱,

(1.华南农业大学兽医学院，广东广州510642 ； 2.广东温氏大华农生物科技有限公司，广东新兴527400)

猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科、圆环病毒属，是一种无囊膜、共价闭合的单股环状DNA病毒，也是目前已知最小的动物DNA病毒。猪圆环病毒目前主要由PCV1、PCV2和PCV3组成。PCV2主要包含2个开放性阅读框ORF1和ORF2，分别编码复制酶(Rep)和衣壳蛋白(Cap)，ORF1是最大的ORF，编码296aa的Rep蛋白，ORF2编码的Cap蛋白是PCV唯一的结构蛋白和主要抗原[1-3]，临床上主要表现为感染的仔猪消瘦、关节肿胀、呼吸系统疾病和母猪繁殖障碍等[4-5]。2015年PCV3在美国首次被发现，随后在北美，亚洲，欧洲等3个大洲多个国家被检出患病猪只的组织中含有PCV3[6]。目前，PCV3已经成为造成养猪业损失的重要病因之一，并且还有加剧的趋势。可见，及时掌握我国PCV3的流行状况及建立快速，准确，简单有效的检测方法迫在眉睫，本实验室建立了一种简单、特异、灵敏的PCR检测方法，同时利用该方法对我国14个省市的病猪样品进行检测并测序，通过同源性分析，为预防和控制PCV3的流行传播奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料样品 样品主要采集自河南、陕西、江西、广西、四川、重庆等14个省(市)的90多个大型猪场的322份疑似感染病料。

1.1.2 毒株 猪瘟病毒毒株(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株(PRRSV)、猪圆环病毒2型病毒毒株(PCV2)、猪伪狂犬病病毒株(PRV)由本实验室保存。

1.1.3 主要试剂 DNA抽提试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司，TAE 缓冲液(Tris-acetate-EDTA)购自上海百赛生物技术有限公司，PCR试剂盒、质粒回收试剂盒、胶回收试剂盒，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据猪圆环病毒3型分离株 PCV3-Hebei-LY_2015(GenBank 登录号：MF318451.1)设计了特异性鉴定引物及Cap蛋白基因序列引物，由上海英潍捷基贸易有限公司合成，引物序列如表1。

表1 引物序列及扩增片段大小

1.2.2 病料DNA抽提 将疑似阳性病料进行剪碎、研磨，加入2倍体积生理盐水配成1∶2的悬液，放入-70 ℃超低温冰箱反复冻融3次后，8 000 r/min离心5 min，收集200 μL样品，参照DNA抽提试剂盒说明书抽提核酸，-20 ℃保存备用。

1.2.3 标准品的构建 将抽提物用鉴定引物PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳并回收，回收产物连接pMD-18T载体后，转化JM109大肠杆菌，经过摇菌挑菌、抽提质粒，送华大基因科技服务有限公司测序。检测其浓度作为阳性标准品备用。

1.2.4 PCR方法的建立 通过改变单一要素分别对模板量(1～2.5 μL)、PCR循环次数(25～40)、退火温度(52.5 ℃～59.6 ℃)等条件进行优化，以获得最佳的PCR反应条件。

1.2.5 特异性试验 分别选取猪圆环病毒3型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒的病毒液提取基因组后用以上鉴定引物及优化后的条件进行PCR扩增、电泳，检测其特异性。

1.2.6 敏感性试验 将标准品PMD-PCV3进行10-1～10-9稀释，利用优化后的条件分别进行PCR扩增、电泳，检测敏感性。

1.2.7 重复性试验 采用优化后的PCR方法对来自全国的3份阳性病料提取的DNA分别重复3次扩增，共扩增9次，重复多孔同步检测验证其重复性。

1.2.8 临床样品检测 对来自云南、四川、重庆等14个省(市)90多家猪场的322份样品进行检测，样品包括流产胎儿和仔猪的心脏、肝脏、肺脏、肾脏等组织。

1.2.9 PCV3 Cap蛋白基因检测 应用1.2.1设计的引物对部分省份的PCV3阳性样品进行PCR扩增 Cap蛋白基因并测序，采用DNAMAN软件和MEGA6软件与GenBank登陆的PCV3 Cap蛋白基因序列进行对比分析。

2 结果

2.1 标准品的构建 将鉴定引物经PCR获得的约330 bp目的条带回收，连接pMD-18T载体后，转化大肠杆菌JM109，平板培养后经PCR挑取阳性菌株，测序后与GenBank登陆的PCV3序列比对，同源性为99%～100%，表明该序列确实为PCV3序列。取阳性菌株培养提取质粒后，检测其浓度为252 ng/μL，经计算拷贝数为8.3×109/μL。将质粒作为阳性标准品放-20 ℃保存备用。

2.2 PCR方法的优化和建立 通过对PCR反应条件的优化，得到PCR扩增的最佳反应体系为：rTaqMix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板2.5 μL，加ddH2O至总体系20 μL。PCR最佳反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56.7 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40个循环。如图1所示，成功扩增到约330 bp的PCV3目的条带。

2.3 特异性试验 结果显示，猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型病毒(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)病毒液均未扩增到条带(图2)，PCV3阳性样品扩增到约330 bp的条带，表明建立的PCR检测方法具有良好的特异性。

图1 PCV3 核酸PCR扩增

M：Marker； 1～2：PCV3目的条带

图2 特异性试验

M：DL-2 000 ； 1：PCV3 ； 2：CFSV ； 3： PRRSV ； 4： PCV2 ； 5： PRV

2.4 敏感性试验 将标准品PMD-PCV3作10倍系列稀释，从10-1稀释至10-9，用建立的PCR方法分别进行扩增、电泳，检测引物的敏感性。结果显示，当样品稀释至10-8时，用该方法检测为阳性(图3)，通过换算其检测下限为830拷贝/μL，表明该方法具有良好的敏感性。

图3 敏感性试验

M： DL-2 000 ； 1～9泳道：模板浓度分别为10-1～10-9

2.5 重复性试验 用建立的PCR方法对来自全国的3份阳性病料提取的DNA扩增，每份重复3次共扩增9次，结果均为阳性，表明该方法重复性良好。

2.6 临床样品检测 从2017年10月份至2018年7月份，对来自云南、四川、重庆等14个省(市)的94家猪场的332份样品进行检测，样品包括流产胎儿和仔猪的心脏、肝脏、肺脏、肾脏等，检测结果显示：在8个省(市)的样品中检测到PCV3(表2)， 猪场阳性率为36.5%，个体阳性率在23.2%，其中养猪大省，四川、广东、河南等检出率均高于27%，从PCV3的流行分布情况来看，主要集中在我国中西部、中东部以及华南地区。

表2 样品检测信息

2.7 PCV3的Cap蛋白基因分析 随机挑取6个省(市)的样品进行Cap蛋白基因扩增并测序。经同源性分析，6份Cap蛋白基因序列之间的同源性为98.6%～100%，与国内序列同源性为97.3%～99.3%，与泰国序列为97.6%～98.3%，与韩国序列为97.5%～99.3%，与巴西序列为97.6%～99.2%，与意大利序列为98.6%～99.3%，与美国序列为97.3%～98.1%，与瑞典序列为97.8%～98.5%(图4)；经分子进化分析，2018年检测到的6个PCV3 Cap蛋白基因序列与2016-2017年间检测到的并不在同一进化分支，而是独立处于另一小分支上(图5)。

3 讨论

2015年美国堪萨斯州立大学Palinski等研究人员从北卡罗来纳州的一个暴发PDNS(皮炎和肾病综合征)的猪场中分离到了一种新型猪圆环病毒，并且通过宏观基因组测序和遗传进化分析将其命名为猪圆环病毒3型(PCV-3)[2]。随后在西班牙、泰国、韩国等地相继报道在患病猪只中发现PCV3[6]。2017华中农业大学何启盖教授对我国PCV3临床调查，经调查发现我国8个省和1个直辖市存在PCV3阳性猪只[1-3]，同时刘晓旭等人对我国安徽、山东等10个省份的66个猪场进行流行病学调查显示，我国部分省(区)阳性率较高[7]。因此如何及时、准确的检测PCV3，成为预防和控制PCV3的关键。PCR技术具有灵敏、简单、特异、快速且易于操作等特点，得到了广泛的应用[8]。

图4 PCV3 Cap蛋白基因同源性分析

图5 PCV3 Cap 遗传进化树

应用本实验室所建立的PCV3检测方法对来自河南、陕西、江西、广西、四川、重庆等14个省及直辖市332例疑似病料进行检测，结果显示，猪场阳性率为36.5%，个体阳性率为23.2%。由此可见，PCV3已经成为流行趋势，并具有蔓延的态势。本研究并未对东北三省的PCV3流行情况进行调查，但是根据目前报道来看，东北三省PCV3阳性率并不高，由此可以看出PCV3流行传播具有区域性。

本研究随机挑取6个省(市)的样品进行Cap蛋白基因扩增并测序，与2016-2017年间世界各地在GenBank登陆的序列进行比较，结果显示，6份Cap蛋白基因序列之间的同源性为98.6%～100%，与国内序列同源性为97.3%～99.3%，与泰国序列为97.6%～98.3%，与韩国序列为97.5%～99.3%，与巴西序列为97.6%～99.2%，与意大利序列为98.6%～99.3%，与美国序列为97.3%～98.1%，与瑞典序列为97.8%～98.5%，表明不同地域之间的PCV3 Cap基因序列已存在一定的差异，从遗传进化树分析，2018年所检测到的6个PCV3 Cap蛋白基因与2016-2017年检测到的并不在同一进化分支，由此推测PCV3随着时间推移，存在部分的基因突变。通过本次试验，可以为进一步预防和控制PCV3的传播蔓延打下理论基础。