肾功能对慢性肾脏病血清游离轻链的影响

李旭涵 陈 欣 谌达程 刘 丰 王荔枝 陈朝红 程 震

背 景

单克隆免疫球蛋白病(monoclonal gammopathy，MG)是以克隆性增殖的浆细胞或B淋巴细胞为基础所导致的全身多系统受累的一类疾病，其诊断需通过检测循环中单克隆免疫球蛋白(MIg)或轻链成分，最常用的检测方法有血清蛋白电泳、尿本-周蛋白检测、免疫固定电泳等。近年来，游离轻链(free light chian,FLC)检测作为一种更敏感的筛查方法，渐被应用到MG的筛查、诊断和疗效评判，异常的游离轻链比值常提示MG相关疾病[1-3]。

FLC在肾脏清除，在近端肾小管上皮细胞刷状缘形成受体-配体复合物，经胞吞作用至囊泡中，最终在成熟的溶酶体内被水解为肽和氨基酸[4]。FLC有κ和λ两种类型，在肾功能正常的情况下，κ/λ比值在0.26～1.65范围[3,5]。中国健康人群κ/λ的参考范围在0.32 ～1.52[6]。肾功能不全时，肾脏对FLC的清除减慢，网状内皮细胞成为FLC的主要的清除途径，血清中FLC的半衰期变长，血清κFLC、λFLC水平逐渐升高，κ/λ超出上述范围达到0.37～3.1[7-8]。选择何种范围作为血清游离轻链比值的正常参考范围仍存在争议[9-13]。但在慢性肾脏病(CKD)人群中，血清FLC及比值的参考范围仍不明确，本研究通过对不同肾功能分期的患者的FLC水平及其他临床资料进行单中心回顾性研究，探究肾功能对FLC水平、比值的影响，初步确定参考范围，并探索其在MG诊断上的应用。

对象和方法

研究对象纳入病例符合：(1) 东部战区总医院肾脏病国家级临床研究中心住院，病历数据完整；(2) 2016年10月至2017年12月行血清FLC、肾功能及尿液检测。(3)检测前1月内未进行化疗、自体干细胞移植或大剂量免疫抑制治疗。纳入患者共2 711例，其中MG患者278例，非MG患者2 433例。重复住院患者仅提取第一次住院资料。

实验室指标血清FLC使用Freelite法检测。肾功能指标包括血清肌酐、胱抑素C及估算的肾小球滤过率(eGFR)(CKD-EPI公式)。尿液指标包括24h尿蛋白定量、尿沉渣红细胞计数、视黄醇结合蛋白(RBP)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)。

肾功能分组标准:正常肾功能组(n=778):eGFR 90～125 ml/(min·1.73 m2); eGFR升高组(n=329):eGFR>125 ml/(min·1.73 m2); 轻度肾功能不全组(n=511):eGFR 60～90 ml/(min·1.73 m2); 中度肾功能不全组(n=423):eGFR 30～60 ml/(min·1.73 m2);重度肾功能不全组(n=198):eGFR 15～30 ml/(min·1.73 m2); 极重度肾功能不全组(n=125):eGFR≤15 ml/(min·1.73 m2)。另有69例患者检测时已接受血液透析。

统计学方法使用RStudio(1.1.456)和SPSS 21.0进行统计分析及图表制作。组间差异使用Mann-Whitney U检验，各肾功能分组的组间差异使用Kruskal-Wallis检验。相关性由Spearman秩相关分析评估。P<0.05为差异有统计学差异。参考范围制定方法部分参考实验室指标参考范围制定指南第三版(C28-A3)[14]。敏感性、特异性、ROC曲线、曲线下面积(AUC)评估诊断效率。

结 果

研究人群男性1 646例，女性1 065例，平均年龄44.95±14.82岁。部分患者合并病毒性肝炎、感染(P<0.05)及合并自身免疫疾病者(P<0.01)FLC有较明显差异，这些病例(n=320)在确定参考范围时被排除(图1)。

图1 研究人群分组流程图eGFR:估算的肾小球滤过率

血清FLC参考范围与肾功能以肾功能正常并除外自身免疫疾病、肝炎病毒感染患者作为肾功能正常组患者(n=690)，得到95%置信区间：κFLC范围10.75～68.22 mg/L，λFLC范围12.16～50.29 mg/L，κ/λFLC范围0.49～1.93。

相关分析示：κFLC与血清肌酐、胱抑素C呈明显正相关，与eGFR呈明显负相关，其中与胱抑素C相关性最强(相关系数0.72)；λFLC与κFLC相同，亦与胱抑素C呈较强的正相关(相关系数0.69)，与尿红细胞、尿蛋白定量等指标相关关系较弱。κ/λ有相同的相关倾向，但与eGFR相关性较强(相关系数-0.34)(图2)(P<0.01)。

图3 肾功能与FLC级比值的小提琴图、散点图FLC：游离轻链；血清FLC在不同肾功能分组存在差异，当肾功能下降时，血清FLC呈升高趋势；Normal：正常肾功能组；Mild：轻度肾功能不全；Moderate：中度肾功能不全；Severe：重度肾功能不全；Extreme：极重度肾功能不全；HD：血液透析；A：κFLC与肾功能分组小提琴图，组间差异 χ2=1101.3，df=5，P<2.2e-16；B：λFLC与肾功能分组小提琴图，组间差异 χ2=957.2，df=5,P<2.2e-16；C：κ/λ比值与肾功能分组小提琴图，组间差异 χ2=273.62,df=5,P<2.2e-16；D：κ/λ比值与eGFR散点图，呈负相关，红色为线性拟合(截距1.540889，斜率-0.003986，P<0.001 )，橙色为平滑曲线拟合

κFLC、λFLC随肾功能恶化逐级升高，肾功能不全组的κ/λ较正常肾功能组亦明显升高(P<0.000 1)(图3A～C)。但κ/λ不呈逐级升高趋势，在正常至中度肾功能不全组呈逐级升高，在重度肾功能不全与极重度肾功能不全组κ/λ呈逐级下降(P<0.05)，血液透析组κ/λ与肾功能正常组差异显著(P<0.001)，与其余肾功能不全组均无明显差异(图3C～D)。

CKD患者血清FLC及κ/λ比值的范围较正常肾功能组明显增宽，κFLC范围为11.10～152.89 mg/L，λFLC范围为12.20～118.52 mg/L，κ/λ范围为0.52～2.36。各肾功能组κ/λ参考范围如下：轻度肾功能不全0.55～2.44，中度肾功能不全 0.68～2.43，重度肾功能不全0.59～2.65，极重度肾功能不全0.71～2.37。

图2 FLC与年龄、肾功能指标、尿蛋白、尿红细胞、肾小管损伤指标等的相关性矩阵蓝色为正相关，红色为负相关，相关性越强颜色越深，右侧饼图代表相关系数。age：年龄；FLC：血清游离轻链；SCr:血清肌酐；eGFR：估算的肾小球滤过率；CysC：血清胱抑素C；uRBC：尿红细胞计数；UP：24h尿蛋白定量；uRBP，尿视黄醇结合蛋白；uNAG:尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶

血清κ/λ比值的诊断效率为更有效地诊断MG患者，我们选取非MG患者及血免疫固定电泳阳性的MG患者共2 610例，对κ/λ的诊断效率进行评估。前文得到的κ/λ参考范围0.49～1.93在不同肾功能分组的敏感性、特异性、AUC见表1。

表1 κ/λ参考范围0.49～1.93在不同肾功能分组诊断MG*

*:295例估算的肾小球滤过率>125 ml/(min·1.73m2) 及69例血液透析患者未列出

使用前文的κ/λ正常参考范围0.49～1.93，肾功能不全时的扩大范围0.52～2.36，以及既往文献中的诊断范围，计算敏感度、特异度、AUC。其中扩大的范围0.52～2.36诊断效率较高。按照肾功能分层使用不同诊断范围[eGFR≥90 mL/(min·1.73 m2)时使用0.49～1.93作为诊断范围，eGFR 60～90 mL/(min·1.73 m2)时使用0.55～2.44；eGFR 30～60 mL/(min·1.73 m2)时使用0.68～2.43；eGFR 15～30 mL/(min·1.73 m2)时使用0.59～2.65；eGFR≤15 mL/(min·1.73 m2)时使用0.71～2.37]可提高诊断敏感性，且曲线下面积最大(AUC=0.865)(图4，表2)。MG组患者使用上述按照肾功能分层的方法，在不同类型的MG患者κ/λ的敏感度不同(表3)。

图4 不同κ/λ参考范围及分层方法诊断单克隆免疫球蛋白病的ROC曲线

表2 不同参考范围在测试集上的敏感度、特异度、曲线下面积

*:估算的肾小球滤过率(eGFR)≥90 ml/(min·1.73m2)时使用0.49～1.93作为诊断范围， eGFR 60～90 ml/(min·1.73m2)时使用0.55～2.44；eGFR 30～60 ml/(min·1.73m2)时使用0.68～2.43；eGFR 15～30 ml/(min·1.73m2)时使用0.59～2.65；eGFR≤15 ml/(min·1.73m2)时使用0.71～2.37作为诊断范围

表3 κ/λ诊断不同单克隆免疫球蛋白病疾病的诊断敏感性**

**:表中其他诊断患者(n=48)例因样本量较小未列出，包括轻重链沉积病、POEMS综合征、单克隆相关C3肾炎、伴单克隆免疫球蛋白沉积的肾小球膜性病变等

讨 论

近年来，游离轻链检测作为一种更敏感的方法，逐渐应用在MG的筛查、诊断和疗效评判中。2002年，Katzmann等[2]首次报告了127例健康样本的血清FLC检测结果， κ/λ的参考范围为0.26～1.65。2008年，Hutchison等[8]报道688例慢性肾功能不全患者血清κFLC、λFLC水平随肾功能恶化逐渐升高，κ/λ范围也随之扩大至0.37～3.1(以上均100%置信区间)。在肾功能不全患者中，κ/λ的正常参考值范围仍存在争议。2015年，Yadav等[15]建议在晚期肾功能不全患者κ/λ应使用扩大范围0.37～3.1作为诊断范围。2015年Schmidt-Hieltjes等[12]则报道不同肾功能的患者κ/λ范围为0.56～1.86(95%置信区间)，随肾功能下降无显著变化。

本研究首次在CKD患者中探讨了血清FLC及比值与肾功能的关系，并给出相应的参考值范围。随肾功能恶化，CKD患者血清κFLC、λFLC水平逐渐升高，κ/λ范围相应扩大：本研究中肾功能正常时的κ/λ参考值范围0.49～1.93，肾功能不全时参考值范围0.52～2.36。正常情况下κFLC产生更多，和λFLC的产生量之比约为2∶ 1[2]。κFLC多呈单体，λFLC多呈二聚体，使得λFLC的清除速率较慢，所以肾功能正常时血清κ/λ<2[16]。肾功能不全时，FLC清除减慢，使血清浓度升高，且网状内皮细胞逐渐取代近端小管上皮细胞成为主要清除途径，此途径较少受分子量影响，κFLC与λFLC清除趋近同步，使得血清κ/λ较肾功能正常时升高。与κFLC、λFLC不同的是，κ/λ并非随肾功能不全加重而逐级升高，在较严重的肾功能不全时，κ/λ比值上升的趋势有所改变。2015年Schmidt-Hieltjes等[12]发现，κ/λ仅在eGFR 60～90 mL/(min·1.73 m2)与eGFR30～60 mL/(min·1.73 m2)两组，以及eGFR 60～90 mL/(min·1.73 m2)与eGFR 15～30 mL/(min·1.73 m2)两组间存在差异(P< 0.05)，其他组间无显著差异。2015年Erdem等[13]的研究也观察到κ/λ在CKD5期时降低(P<0.05)。但为何出现这种变化有待进一步研究，可能与营养状况、免疫状态异常等因素有关。

本研究中，肾功能相对正常的CKD患者中，FLC的正常参考值范围均较既往文献健康人群的范围更宽且偏高。原因可能与肾脏疾病、年龄、置信区间的选择、机体免疫状态以及住院患者用药有关。尽管我们选择参考范围时，已将存在某些合并症(肝炎、自身免疫疾病等)的患者排除在外，但CKD如IgA肾病、微小病变肾病、糖尿病肾病中多伴随免疫功能紊乱和微炎症状态，这可能是其血清FLC水平高于健康人群的原因。

血清FLC浓度受多种因素影响，随肾功能下降、年龄增长，及感染、免疫紊乱、肝脏疾病时，血清FLC浓度升高；化疗后，血清FLC浓度可减低[8,19-20]。多克隆疾病也影响血清FLC水平，如糖尿病肾病、狼疮性肾炎及间质性肾损伤患者血清FLC水平明显升高，但κ/λ比值仍在正常范围内；自身免疫性疾病患者血清FLC浓度升高，且可与活动性相关[17-18]。另有研究报道慢性阻塞性肺疾病、过敏性疾病等慢性炎症性疾病患者血清FLC升高[19-20]。可能的机制为浆细胞参与了炎症细胞的激活，此过程中产生过量的FLC。而MG不仅影响血清FLC水平，也影响κ/λ范围。

不同类型的MG疾病影响κ/λ比值的诊断效能。在多发性骨髓瘤(MM)、轻链沉积病(LCDD)、系统性淀粉样变性等肿瘤负荷较高的MG疾病，κ/λ诊断敏感性较高，而在肿瘤负荷较低的疾病如伴单克隆免疫球蛋白G沉积的增生性肾小球肾炎中敏感度较差[21-23,25]。不同疾病亚型也影响其诊断，如κ/λ在轻链型MM有着较高的敏感度，完整免疫球蛋白型MM次之，不分泌型MM敏感性较差[24-25]。 所以在使用血清FLC协助临床诊断时，需注意到不同疾病种类及其肿瘤负荷会影响诊断MG的敏感度。

我们将得到的κ/λ范围在本研究的样本中进行检测，按照肾功能不全程度分层使用相应诊断范围时曲线下面积最大，诊断MG的敏感性为78.0%，较既往文献报道更敏感[21]。此方法在我们的样本中，相较既往文献中发表的诊断范围，可明显提高诊断效率。但此方法较为繁琐，临床上可以使用相对更简洁的分层方法，即在eGFR≥90 ml/(min·1.73 m2)时使用0.49～1.93作为诊断范围，eGFR<90 ml/(min·1.73 m2)时使用扩大的范围0.52～2.36。此方法在我们的样本中诊断敏感性亦达73.45%，曲线下面积为0.835。

κ/λ诊断MG存在一定的假阳性。有研究报道在非MG的患者中，有30.1%患者的血清κ/λ超出0.37～3.1范围，在炎症/肝病等情况下，球蛋白总体水平升高，游离轻链产生更多，可导致比值超过正常范围[26]。我们建议使用血清FLC筛查MG时，需要考虑患者肾功能及免疫状况，联合免疫固定电泳、血清蛋白电泳及尿液检测，提示异常或临床高度怀疑MG可能时，应进一步行骨髓检查或组织活检[21,27]。MG所产生的单克隆FLC是否具有特殊构型或抗原表位，是否可以通过更特异的方法对单克隆FLC进行检测，亟待进一步研究。

本研究首次在CKD患者群评估血清游离轻链并给出参考范围，样本量较大，具有临床实用价值。但作为单中心回顾性研究，未能在其他人群中验证，且缺乏健康人群作为对照，有一定的局限性，需进一步多中心前瞻性研究。