7/8肾切除构建Ⅳ型心肾综合征模型

保靖夫 佘琴英 窦为娟 卢颖辉 唐 蓉 杨 帆 刘 丰 王 根 刘志红 郑春霞

心肾综合征(CRS)是指心脏或肾脏中任何一个器官损害导致另一器官出现功能障碍的临床综合征。其中，由慢性肾脏病(CKD)引起的心血管病变被急性透析质量指导组(ADQI)划分为Ⅳ型CRS[1]。大量研究显示，Ⅳ型CRS是CKD患者最常见的死因[2]。因此，Ⅳ型CRS模型构建，对深入研究Ⅳ型CRS的分子病理机制、进而提高其防治水平并改善CKD患者预后具有重要意义。

左心室肥厚(LVH)是Ⅳ型CRS患者最常见的心血管病变，也是患者出现充血型心力衰竭、心律失常或缺血性心肌病的病理基础[3-4]。CKD所致LVH是Ⅳ型CRS的主要研究对象。目前大部分相关实验均采用5/6肾切除制备Ⅳ型CRS模型，但不同实验却给出了不同的成模时间(2～5周不等)[5-7]。这提示5/6肾切除构建的Ⅳ型CRS模型的稳定性不足，给相关研究带来不确定因素。本实验在5/6肾切除 CKD模型的基础上，采用7/8肾切除构建CKD模型，对其肾功能及心脏的病理生理指标进行动态评价，以期制作成功率高、稳定性强的Ⅳ型CRS模型。

材料与方法

实验动物清洁级雄性Sprague Dawley (SD)大鼠39只，体重150～160 g，由东部战区总医院比较医学科提供。

主要试剂异氟烷(河北一品制药有限公司)；4%中性甲醛溶液(Solarbio)；HE染色试剂盒(Solarbio)；Masson染色试剂盒(Solarbio)；RNA提取试剂盒(Ambion)；qPCR试剂盒(Takara)；麦胚芽凝集素(Wheat Germ Agglutinin,WGA)(Thermo Fisher Scientific)；成纤维细胞因子23(FGF-23) Elisa Kit(Kainos Laboratories)。

主要仪器MSS3小动物麻醉机(任谊生物)；BP2000小动物血压仪(Visitech Systems)；DXL-D大鼠代谢笼(Asylum Research)；AU680全自动生化分析仪(Beckman Coulter)；Vevo2100高分辨率小动物超声成像系统(VisualSonics)；DM5000B显微镜(Leica Microsystems)。

实验方法

分组 39只SD大鼠，随机分为手术组及假手术组，手术组21只、假手术组18只。

CKD模型制备 适应性饲养3d后，手术组以5%异氟烷诱导麻醉、2%异氟烷维持麻醉，俯卧位固定于手术台上。右侧背直肌外侧局部备皮，常规消毒，无菌操作下切开右背侧皮肤及各层组织，打开肾脂肪囊以暴露右肾，分离肾上腺并固定右肾，肾上、下极均切除大部，切除范围见图1A(大约切除一侧肾脏的3/4)，明胶海绵压迫止血，逐层缝合。术后1周进行第2次手术，同法麻醉，切开左侧肋下背直肌外侧皮肤及各层组织以暴露左肾，结扎肾蒂，切除左肾(注意不要伤及肾上腺)，逐层缝合。假手术组以同法麻醉后，仅分两次剥离左肾及右肾脂肪囊，但不切除。术后饲养于室温24℃、12h光照、12h黑暗的清洁级动物房中，充足供水和标准饲料喂养。

心脏M型超声检测 7/8肾切除后1周、3周和5周进行心脏超声检测，观察心脏的动态变化。异氟烷麻醉后胸骨区皮肤备皮，Vevo2100测定左室壁厚度、左室内径、射血分数、左心室质量等指标。

血压测定 7/8肾切除后1周、3周和5周利用BP2000进行血压测定，收集收缩压及舒张压数据。

肾功能及钙磷代谢指标测定 7/8肾切除第2次手术后1周、3周和5周将大鼠置于代谢笼24h，收集尿液，麻醉后称取体重，摘除眼球取血，室温静置2h后4 500g，4℃，离心5 min以制备血清。全自动生化分析仪测定尿肌酐、血清肌酐，血清尿素氮，血清钙，血清磷浓度。并测定血清FGF-23浓度。利用下述公式计算肌酐清除率：

肌酐清除率=(尿液肌酐浓度×每分钟尿量)/(血清肌酐浓度×体重(g)/100)

心脏重量指数的测定 7/8肾切除第2次手术后1周、3周和5周各处死一批大鼠(每次均为假手术组6只，手术组5或6只)。麻醉并留取血液后，左心室灌注生理盐水，洗净淤血后取出心脏，修剪多余组织并用滤纸吸干其表面水分。称量心重，计算心重/体重。利用超声获得的左心室质量，计算左心室重/心重及左心室重/体重。

心脏及肾脏病理 沿垂直于肾脏长轴的方向横断肾脏，取部分放入4%中性甲醛中固定，制备石蜡切片，用Masson染色试剂盒染色后200倍镜下拍照，观察纤维化情况。心脏放入4%中性甲醛中固定，制备石蜡切片，用HE染色试剂盒染色后8倍镜下拍照，观察心肌肥厚情况；用Masson染色试剂盒染色后200倍镜下拍照，观察纤维化情况。

心肌肥厚指标的测定 取左心室部分约30mg组织，RNA提取试剂盒提取总RNA。总RNA进行二步法qPCR，以18S为参比基因对心房钠尿肽(ANP)及脑尿钠肽(BNP)进行相对定量。PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

统计学方法应用Graphpad Prism 8软件进行分析，数据以均数±标准差表示，两组之间差异采用t检验或Mann Whitney检验分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一般情况手术组第1次手术后全部存活，第2次手术后1周内共死亡4只，存活率81%。其中2只死亡于术后第3天，1只死亡于术后第5天，1只死亡于术后第6天。假手术组全部存活。第2次手术后1、3、5周观察大鼠(图1B)，可见假手术组皮毛致密、整齐而有光泽，反应速度正常，进食进水正常；手术组在7/8 肾切除后1周尚无明显异常，精神尚可，活动正常，但7/8 肾切除后3周至5周逐渐出现不同程度皮毛蓬松、枯槁无光泽，精神不振，食欲减退。

CKD模型的肾脏表型7/8肾切除后1、3、5周，可见大鼠体重增加缓慢，与假手术组的差异逐渐

图1 肾脏切除示意及观察时间安排A：肾切除范围示意图，虚线外为5/6 肾切除切除肾组织范围，实线外为7/8 肾切除切除肾组织范围；B：术后观察时间及观察内容

增大(图2A)。手术组血清肌酐在7/8 肾切除后1周时极度升高、3周时有所降低，但在第5周又出现上升的趋势(图2B)。对应的肌酐清除率亦出现降低、升高、再降低的趋势(图2C)。手术组血尿素氮则呈现逐渐上升的趋势(图2D) 。手术组出现明显的高血压，收缩压及舒张压均表现出逐渐上升的趋势(图2E、F)。与假手术组相比，手术组血清钙呈现逐渐降低的趋势，血清磷呈现逐渐升高的趋势。FGF23作为一重要的钙磷调节分子[8]，亦因高磷血症而呈现逐渐升高的趋势(表2)。肾组织Masson染色可发现，手术组在7/8 肾切除后1周即有部分肾小管扩张，术后第3周扩张的肾小管增多，术后第5周出现明显的肾间质纤维化(图2G)。上述结果表明7/8 肾切除后5周，CKD模型构建成功。

图2 慢性肾脏病模型的肾脏表型A：手术组体重增长缓慢，与假手术组体重差距逐渐增加；B：手术组血清肌酐呈现高-低-高趋势；C：手术组肌酐清除率呈现低-高-低趋势；D：手术组血清尿素氮呈现增高趋势；E～F：手术组收缩压及舒张压呈现增高趋势；G：手术组肾小管扩张并逐渐出现间质纤维化；与同周假手术组比较；**：P<0.01

表2 术后血清钙、磷及成纤维细胞生长因子23浓度

*及**均为与同周假手术组比较；*：P<0.05；**：P<0.01

CKD模型的心脏表型7/8肾切除后1、3、5周进行心脏超声观察，可见大鼠在7/8 肾切除后第5周出现明显的心肌壁厚度增加(图3A)。M型超声显示舒张期室间隔厚度(IVS;d)及舒张期左心室后壁厚度(LVPW;d)均呈现逐渐增加的趋势，并在7/8肾切除后第5周出现明显的肥厚(图3C、D)；假手术组与手术组间的舒张期左心室内径(LVID;d) 在术后第5周则未出现明显差异，提示7/8肾切除后 5周大鼠心脏呈现向心性肥厚(图3E)。具体超声数据可见表3。与假手术组相比，手术组心重/体重、左心室重/心重及左心室重/体重在术后第5周均有显著差异(图3F～H) 。上述结果表明7/8 肾切除后第5周大鼠出现明显的左心室向心性肥厚。

图3 慢性肾脏病模型的心脏表型IVS;d：舒张期室间隔厚度；LVPW;d：舒张期左心室后壁厚度；LVID;d：舒张期左心室内径 A～B：手术组在7/8肾切除后第5周出现LVH；C～D：手术组在7/8肾切除后第5周出现的IVS;d及LVPW;d明显增加；E：手术组与假手术组的LVID;d无显著差别；F～H：手术组术后第5周出现心重/体重、左心室重/心重及左心室重/体重显著增加；*：P<0.05；**：P<0.01

表3 超声心动图结果

IVS;d：舒张期室间隔厚度；LVPW;d：舒张期左心室后壁厚度；LVID;d：舒张期左心室内径 IVS;s：收缩期室间隔厚度；LVPW;s：收缩期左心室后壁厚度；LVID;s：收缩期左心室内径；与同周假手术组比较；*：P<0.05；**：P<0.01

CKD所致LVH的病理学性质由于7/8 肾切除后第5周大鼠出现明显的心肌肥厚，因此选择第5周的大鼠心肌组织进行进一步观察。心脏横截面切片观察显示明显的左心室肥厚(图3B)。WGA染色可见，相较于假手术组，手术组出现明显的心肌细胞横截面积增加，说明7/8肾切除可直接导致心肌细胞的肥大，这也是心肌肥厚的组织学基础(图4A、B)。Masson染色后观察切片，假手术组心肌细胞分布均匀且心肌间质无明显纤维化，而手术组则出现心肌间质胶原沉积、纤维化，心肌组织结构紊乱(图4C)。实时定量PCR显示手术组心肌组织肥厚指标ANP及BNP出现明显上调 (图4D)。上述结果表明7/8肾切除后第5周大鼠Ⅳ型CRS模型构建成功。

图4 7/8肾切除后第5周大鼠出现病理性LVHANP：心房钠尿肽；BNP：脑尿纳肽；LVH：左心室肥厚；A～B：手术组在7/8肾切除后第5周出现明显的心肌细胞横截面积增加；C：手术组在7/8肾切除后第5周出现明显心肌结构紊乱、间质纤维化；D：手术组在7/8肾切除后第5周心肌组织出现明显的ANP、BNP表达上调增加；**：P<0.01

讨 论

目前认为CKD患者的心血管并发症是影响其预后的重要因素[9]，甚至轻度肾功能异常也可显著增加心血管疾病的风险[10]。ADQI将慢性原发性肾脏疾病造成心血管功能异常的CRS划分为Ⅳ型CRS[1]。Ⅳ型CRS 患者的心肌细胞将不可避免地出现肥大及凋亡，由此导致心肌肥厚、纤维化甚至心力衰竭[11]。Ⅳ型CRS最主要的病理特征是LVH，大约65%的透析前患者出现LVH[12]，透析超过5年的患者几乎都伴有LVH[13-14]。LVH主要由血液动力学因素及非血液动力学因素引发，而后者又包括神经-内分泌紊乱、炎症等[15]。非血液动力学因素中涉及极为复杂的分子调控网络，而目前对其了解极为有限。为进一步研究Ⅳ型CRS，动物模型的构建显得极为必要。

目前实验多采用SD大鼠及5/6 肾切除来构建Ⅳ型CRS模型，然而模型构建时间、是否需要其他辅助成模手段均无一致定论。不同研究组给出的成模时间均有不同，如术后2周[5]、4周[7]或5周[16]均有报道模型成功。一些研究人员术后采用高磷饲料喂养[17]，但也有采用标准饲料喂养[18]，却同样可出现LVH。我们在预实验时制作了SD大鼠5/6肾切除 CKD模型，发现5/6 肾切除后第5周直至第10周，与假手术组相比，手术组虽然出现血清肌酐升高，左心室心肌肥厚的形态学指标(心脏超声及左心室重/体重)并未出现统计学差异(数据未显示)。这些均说明5/6肾切除法制备Ⅳ型CRS模型的可靠性较低。

最近，Shi等[19]利用129SV小鼠采取一次性顺铂腹腔注射配合高磷饮食成功地构建了急性肾损伤(AKI)-CKD模型，并在造模后20周观察到了明显的心肌肥厚。该造模方法较为简便，且存活率在80%以上，然而此法是否可用于大鼠仍不清楚，因此我们仍然选择肾切除制备大鼠Ⅳ型CRS模型。5/6 肾切除法制备Ⅳ型CRS模型的可靠性较低，是否可通过增加肾组织切除量加重肾损伤，最终制备稳定的Ⅳ型CRS模型？

7/8肾切除后，大鼠死亡集中于术后3天到第7天，提示手术并发症(如出血、麻醉过深等)致死的可能性较低，肾切除所致急性肾损伤可能是大鼠死亡的主要原因。7/8肾切除的死亡也与术者操作水平有关，因此改善手术环境、提高操作水平等可能会进一步提升7/8肾切除大鼠的存活率。7/8肾切除后，手术组肾单位数目大幅度降低，出现血尿素氮和血清肌酐明显升高，肌酐清除率降低，并伴有高血压、高磷血症、一定程度的低血钙及高FGF-23血症，其中高FGF-23血症常由肾功能受损后导致的钙磷代谢紊乱所致，并可直接导致LVH[5]，上述结果表明CKD模型构建成功。同时，手术组在7/8肾切除后5周心肌壁厚度、心重/体重、左心室重/心重及左心室重/体重均出现显著增高，同时出现心肌细胞肥大、心肌间质纤维化及肥厚指标ANP、BNP表达上调。因此，7/8肾切除后5周手术组不仅可出现明显CKD表现，尚伴有明显的心肌肥厚，表明Ⅳ型CRS构建成功。

综上所述，大鼠7/8肾切除能在无需高磷饲料喂养的情况下在较短时间内形成稳定的Ⅳ型CRS模型，这对Ⅳ型CRS的机制研究及药物开发均有重要意义。