不同表面灭菌对棉花茎秆内黄萎病菌分离效果的比较

孙 艳，石新建，王振辉，冯丽凯，赵 静，刘 政

(新疆农垦科学院植物保护研究所，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意义】棉花黄萎病(cottonVerticilliumwilt)是一种世界性土传维管束萎蔫病害，近年来在我国主产棉区，尤其是在长江流域、黄河流域和新疆棉区持续暴发为害，发病面积呈现出了高速扩张趋势，黄萎病的发生为害日趋严重，造成严重损失[1-3]，加强棉花黄萎病的研究对防治该病有实际意义。 【前人研究进展】棉株体中分离获得棉花黄萎病菌是开展致病力分化和遗传变异的基础，而前人研究结果表明，棉花的根、茎和叶中含有600余种内生菌和病原菌，约29个属，43个种[4]。分离棉花黄萎病菌时，因为大量棉株样品在运输和保存过程中未能及时处理，使得棉株体表面存在大量寄/腐生菌和体内存在大量内生菌而导致后续分离困难，选择合适的灭菌材料和方法成为影响分离效率的关键因素。目前国内外对病原菌轮枝菌的灭菌分离方法均不尽相同，常用的表面消毒剂种类有乙醇、次氯酸钠和升汞等[5-7]。【本研究切入点】所选用的灭菌剂种类不同，灭菌的时间和方法也各有差异，尤其是在发病棉株材料采集和样品保存条件差异下，均对病原菌的成功分离有显著影响。研究筛选一套标准的表面灭菌分离获得棉秆内黄萎病、病原菌的方法。【拟解决的关键问题】根据棉花样品材料腐烂程度的不同，以最大化分离出黄萎病菌为最终目的。选择适合的灭菌剂种类和灭菌方法流程。筛选出一套标准的较为适宜的分离棉秆黄萎病菌的灭菌材料和方法。

1 材料与方法

1.1 材 料

选择新疆生产建设兵团棉花棉花种植区，一师16团、七师125团、八师142团和新湖农场重度发病棉花茎杆作为供试材料。根据棉秆在运输保存过程中的腐败程度，划分三个等级：Ⅰ、新鲜棉秆(棉秆表皮新鲜，完整；81团五连)，Ⅱ、轻度腐败棉秆(棉秆表皮轻度变黑褐色，表皮完整；新湖农场)，Ⅲ、重度腐败棉秆(棉秆表皮完全变黑、腐烂；16团14连)。将供试材料分别用流水反复冲洗，去除棉秆表面杂质。剥皮，切成5 cm左右小段，备用。

选择性PDA培养基制备：加热PDA培养基至溶解，冷却后加入抗生素(链霉素：氯霉素：青霉素m/m，1∶1∶1)混合液，分别制备含抗生素浓度100 、200 、300、400和500 mg/L的选择性PDA培养基。

1.2 方 法

棉花植株体内含有各种细菌和真菌，之间存在共生或拮抗的关系[8]。为排除细菌对分离轮枝菌的潜在影响，配置含不同浓度抗生素混合液的培养基进行抑制细菌试验。

棉花茎杆内生长多种类型真菌，真菌种类不同，其寄生或共生的部位也不同[9]。试验用四种不同的表面灭菌方法和灭菌时间处理材料，确定对目标病原菌大丽轮枝菌的最佳分离条件。

将已处理的三个等级的供试材料棉秆，各放入75%的乙醇、0.1%的升汞、5%次氯酸钠和5%次氯酸钠+75%乙醇(依次处理)溶液中，分别灭菌处理1、2、3、4和5 min，对Ⅲ型棉秆分别灭菌处理1、2、3、4、5、6、8和10 min无菌水冲洗2次。无菌操作台内阴干，纵向切取1 cm小段，四等分。

每个处理接种到含500 mg/L抗生素的选择性PDA培养基中，每个培养皿接种6个棉秆小段，5次重复。10 d统计真菌生长个数和细菌生长个数。

1.3 数据处理

试验数据为5次重复试验的平均值取标准差。利用Microsoft Excel 2016软件进行数据分析和作图，应用SPSS22统计软件进行方差分析及LSD检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同抗生素浓度对棉秆内生细菌生长影响

随着培养基中抗生素浓度的升高，三种棉秆类型分离的细菌生长率均呈下降趋势。不添加抗生素(0 mg/L)的培养基内，三种棉秆类型的材料细菌生长率均达90%以上，当抗生素浓度为400 mg/L时，Ⅰ型棉秆接种的培养基内无细菌生长，当抗生素浓度为500 mg/L时，三种棉秆类型接种的培养基内均无细菌生长。图1 用大丽轮枝菌分别接种含抗生素浓度0和500 mg/L PDA培养基，7 d后，该两个处理间菌落大小无显著差异。因此，可以确定，含500 mg/L浓度抗生素的PDA培养基对大丽轮枝菌生长无显著影响，并其对棉秆内细菌抑菌率达100%。后续试验所有培养基均为含500 mg/L浓度抗生素的PDA培养基。

2.2 不同消毒处理对Ⅰ型棉花茎秆黄萎病菌分离和培养的影响

研究表明,在四种不同的表面消毒处理下，杂菌的生长率随着处理时间的延长总体呈降低趋势，处理初期杂菌生长率基本均为100%；而大丽轮枝菌的分离率随着处理时间延长呈先升高后降低的趋势，分别在75%乙醇处理4 min、5%NaClO处理3和4 min、0.1%升汞处理1和2 min、75%乙醇+5%NaClO处理4 min时，大丽轮枝菌分离率最高，分别为70%、53.33%、16.67%和70%。图2

2.3 不同消毒处理对Ⅱ型棉花茎秆黄萎病菌分离和培养的影响

研究表明,4种不同处理方式对Ⅱ型棉秆内真菌分离率的试验结果与Ⅰ型类似，杂菌生长率随着灭菌时间的延长而降低，并在处理初期1 min内与对照无显著差异；大丽轮枝菌的生长率随着灭菌时间延长呈先升高后降低趋势，分别在75%乙醇处理4 min、5%NaClO处理3 min、0.1%升汞处理3 min、75%乙醇+5%NaClO处理3 min时分离率最高，分别为90%、76.67%、36.67%和43.33%。图3

注：差异性显著(P<0.05)用不同字母标记

Note: Values followed by different lower case letters are significantly different at 0.05 level

图1 含不同浓度抗生素的PDA培养基对棉秆内生细菌生长抑制
Fig.1 The growth inhibition of bacterial in cotton stalk with different concentration of antibiotics on PDA culture medium

注：不同的大小写字母分别表示杂菌或大丽轮枝菌之间差异性显著(P<0.05)。下同

Note: Different upper and lower case letters indicate that there is a significant difference between the contaminating microorganism or theVerticilliumdahiaeKleb (P< 0.05).The same as below

图2 不同消毒处理下Ⅰ型棉秆内真菌分离率变化

Fig.2EffectsofdifferentdisinfectionmethodsonfungusseparationrateintypeⅠcottonstalk

图3 不同消毒处理下Ⅱ型棉秆内真菌分离率变化
Fig.3 Effects of different disinfection methods on fungus separation rate in typeⅡcotton stalk

图4 不同消毒处理下Ⅲ型棉秆内真菌分离率变化
Fig.4 Effects of different disinfection methods on fungus separation rate in typeⅢcotton stalk

2.4 不同消毒处理对Ⅲ型棉花茎秆黄萎病菌分离和培养的影响

研究表明，在四种不同灭菌处理下棉秆杂菌的生长率随着灭菌时间延长逐渐降低，但是在灭菌处理10 min时，除升汞处理下杂菌生长率10%以外，其余3种灭菌处理的杂菌生长率均在35%以上，且在灭菌初期75%乙醇和5%NaClO处理0～4 min、0.1%升汞处理0～1和2～4 min、75%乙醇+5%NaClO处理0～2和3～6 min彼此均无显著差异；大丽轮枝菌在四种灭菌处理下分离率总体呈先升高后降低趋势，分别在75%乙醇处理8 min、5%NaClO处理8 min、0.1%升汞处理5 min、75%乙醇+5%NaClO处理5 min时分离率最高，分别为36.67%、26.67%、30%和50%。图4

3 讨 论

棉花活体植株各个器官的表面或内部均存在各种微生物，如棉花根、叶部位多存在赤霉属(Gibberella)和青霉属(Penicillium)，茎部表面多存在镰刀属(Fusarium)和链格孢属真菌[10-12]。棉花黄萎病是典型的土传维管束疾病，轮枝菌多存在于木质部维管束部位[4]。传统研究中分离黄萎病病原菌的材料，多数采用乙醇、次氯酸钠和升汞对材料进行表面灭菌，由于材料发病状况的不同，对其进行灭菌的程序亦不相同[13-14]。研究中，将这3种灭菌方法进行四种不同灭菌组合，在不同的处理时间检测其对三种材料中目标病原菌的分离情况。结果表明，含500 mg/L混合抗生素的PDA培养基可完全抑制材料中细菌生长。在四种不同表面灭菌处理下，Ⅰ型材料，75%乙醇和75%乙醇+5% NaClO处理4 min时，病原菌的分离率最高，病原菌生长率70%，其中75%乙醇+5% NaClO处理可完全抑制杂菌生长；Ⅱ型材料中75%乙醇处理4 min条件下病原菌分离率最高，为90%；Ⅲ型材料，75%乙醇+5%NaClO处理5 min时分离率最高，为50%。

4 结 论

添加了抑制棉秆内细菌生长的最少混合抗生素(链霉素：氯霉素：青霉素 m/m，1∶1∶1)浓度为500 mg/L的PDA培养基；同时根据棉秆腐败程度的不同，选择不同的灭菌剂和灭菌时间，即新鲜棉秆材料和轻度腐败棉秆材料表面灭菌的最佳条件为75%乙醇处理4 min，重度腐败棉秆表面灭菌条件为75%乙醇+5%NaClO处理5 min。