黄芪甲苷提取分离实验应用于高职生物学教学的探讨*

颜珊珊 罗 艳 卢豆豆 梁俊玉

（西北师范大学生命科学学院 甘肃兰州 730070）

黄芪（Astragalus）药用历史悠久，古有“补药之长”之称，为历代中医最常用的中药之一。近年来，国内外学者对黄芪的化学组成、药理活性进行了较为广泛的研究。成分分析表明，黄芪内含有甲苷、多糖、三萜、黄酮等成分。药理实验及临床报道表明，黄芪在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、糖尿病、延缓衰老等方面具有重要作用［1］。据统计，以黄芪为原料的中成药达200 多种，是我国出口的商品之一［2］。因此，对黄芪的各成分进行分析具有指导性意义。

黄芪甲苷Astragaloside IV 作为中药黄芪的主要有效成分，可改善心肺功能、降低血压、保护肝脏、增强免疫力、抗疲劳、抑制病毒繁殖和肿瘤生长［3］。本次教学主要以膜荚黄芪或蒙古黄芪为原材料，将黄芪甲苷提取分离技术作为职业院校生物学实验的内容进行尝试，证实黄芪甲苷的提取分离在实验教学中的各环节均具有可控性，学生可顺利完成实验并得到较好的实验结果，利于实验课堂教学目标的有效达成。

1 黄芪甲苷的研究价值

黄芪为膜荚黄芪或者蒙古黄芪的干燥根，又名绵芪，隶属于豆科黄芪属，该属绝大多数植物具有药用价值［4-5］。

黄芪甲苷是一种从黄芪中提取的高纯度药物。黄芪的主要有效成分包括黄芪多糖、黄酮、萜类等物质［4］，其中黄芪多糖的主要有效成分是多糖和黄芪苷。黄芪苷又分为黄芪苷Ⅰ、黄芪苷Ⅱ、黄芪苷Ⅳ，生物活性最好的是黄芪苷Ⅳ，即黄芪甲苷。黄芪甲苷不仅具有黄芪多糖的作用，还具有一些黄芪多糖无法比拟的作用，其药效强度是常规黄芪多糖的2 倍多，抗病毒作用更是黄芪多糖的30 倍［6-9］。由于含量少、效果好，黄芪甲苷更是有“超级黄芪多糖”之称［10］。本次实验教学以纯度为98%的黄芪甲苷为对照品，采用水饱和正丁醇与氨水提取分离黄芪甲苷，HPLC-ELSD 法检测黄芪中甲苷的分离效果。

2 黄芪甲苷提取分离实验教学设计

2.1 教学目标

1）知识目标：①通过查阅相关资料，对中草药黄芪和黄芪甲苷的药用价值产生浓厚的学习兴趣；②掌握黄芪甲苷提取分离的原理，明确实验中的操作步骤、关键环节和注意事项；③能解释黄芪甲苷提取分离过程中各种现象产生的原因。

2）能力目标：①学会并注重高效液相色谱仪（HPLC-ELSD）、旋转蒸发仪等实验设备的使用及注意事项；②掌握分液漏斗分离的原理，并能对黄芪甲苷进行萃取分离。

3）情感态度与价值观目标：对中草药黄芪及黄芪中各有效成分的药用价值产生浓厚兴趣。

2.2 教学活动组织 实验教学活动开始前，教师整理并分发实验资料。为了达到更好的实验教学效果，教师应依据学生不同年龄阶段特征或者成绩，合理分组，每组6 人左右。同时，各组选出组长，负责每组的实验进度安排与督查，并将最终的实验结果向教师汇报。

在实验教学活动中，每组成员必须全部参与活动，亲自操作，互学互助。教师观察并对学生的实验操作过程进行点评与指导。

实验教学活动结束后，各组汇报实验结果，并进行小组间讨论与反思。教师提出意见与点评。

2.3 实验教学进程及安排

2.3.1 材料与仪器

试剂：黄芪甲苷对照品（纯度为98%）、色谱纯乙腈和甲醇、分析纯甲醇、超纯水、水饱和正丁醇（正丁醇∶水=700∶300，静止过夜后取上层溶液使用）、20%氨水。

仪器：高效液相色谱仪、旋转蒸发仪、水浴锅、分液漏斗、粉碎机。

材料准备：本实验选用的黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch）Bge.的干燥根。取适量黄芪，放入50℃的恒温烘箱中，除去水分（直至烘干前后质量相差不到0.1 g）。用粉碎机将黄芪粉碎，备用。

2.3.2 高效液相色谱操作说明

1）上样前：①制备流动相：在A、B、C 3 个瓶中分别装入色谱甲醇、色谱乙腈、超纯水。所有流动相必须先经过抽滤，再超声40 min，目的是除去杂质和气泡；②制备清洗液：在专门清洗的瓶中装入色谱甲醇-超纯水（10∶1）；③装柱：按照箭头指示方向装好柱子；④设置条件：乙腈-水（35∶65）为流动相，流速为1 min／mL，柱温为30℃，气化与雾化温度为50℃，进样量为20 μL。

2）上样中：调整基线（即从0 开始），注射样品（样品不能含有气泡），并对样品命名。

3）上样后：样品结束后，将流动相改为甲醇－水（50∶50）冲洗柱子，直至在纯甲醇冲洗，流速为0.6 min／mL 时，泵压＜50 Mpa，代表柱子冲洗干净，实验结束。

2.3.3 实验操作步骤与流程［11］

1）色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（35∶65）为流动相；蒸发光散射检测器检测。

2）对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加入甲醇制成每l mL 含0.5 mg 黄芪甲苷的对照溶液，即得。

3）实验样品溶液的制备：取本品中粉末约4 g，精密称定，置索氏提取器中。加入40 mL 甲醇，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4 h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10 mL，微热使溶解。用水饱和的正丁醇振摇提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2 次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干。残渣加水5 mL 使溶解，放冷。通过D101 型大孔吸附树脂柱（内径为1.5 cm，柱高为12 cm），以水50 mL 洗脱，弃水液，再用40%乙醇30 mL 洗脱，弃洗脱液，继用70%乙醇80 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干。残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

4）测定法：分别精密吸取对照品溶液，实验样品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪。

2.3.4 实验结果分析与讨论 实验结束后，在教师组织下，学生进行黄芪甲苷专题讨论，并书写实验报告。讨论主要集中在2 个方面，一是评价用HPLC-ELSD 法检测出的黄芪甲苷提取分离效果；二是汇总实验过程中的主要易错操作环节及注意事项。最终由教师点评各小组实验结果及表现。

2.4 实验结果与分析

2.4.1 实验结果 黄芪甲苷在提取分离过程中对温度、湿度的要求并不苛刻，一般实验室都能达到。只要在实验教学过程中，学生能严格按照教师的要求规范操作，注意实验操作的关键环节及注意事项，一般都能得到较好的实验结果，标准品见图1。实验结果表明，黄芪甲苷出峰时间在40 min左右。

本次实验中，全班共36 人，分成6 人一组。其中有4 个小组都得到了较好的实验结果（图2），黄芪甲苷在40 min 左右的时间点出峰，单峰且色谱峰型尖锐对称，明显与其他杂质分离。剩余2 组的实验出现问题（图3），出现平峰，原因是最终定容的体积不同，浓度过大。

2.4.2 实验注意事项分析

1）黄芪甲苷对照品溶液必须在48 h 内使用。

2）索氏提取过程中，第2 次加入的分析纯甲醇量要尽量多些，以防在80℃的水浴锅蒸发下，溶剂难以回流。回流速度控制在1～2 s／滴。学生在操作过程中，要尽量控制平行样的流速保持一致，减少误差。

3）使用分液漏斗时，溶液要充分摇匀。如果力度过小，溶液不能分布均匀，分层不明显；如果力度过大，溶液容易出现乳化现象，静止时间需延长，以便分层明显。

4）使用D101 型大孔树脂前，要先用无水乙醇浸泡一夜。第2 天，装柱过程中，先用去离子水将D101 型大孔树脂冲至无乙醇味，柱高55 cm 左右。

5）用滤纸包裹黄芪样品置于索氏提取器中，要包裹适当。不要裹得过于严实，以防甲醇回流中，不能将样品中间的部分冲洗干净。同时，也不能包裹得过于松散，避免样品漏出滤纸，堵塞回流。

6）在2 次使用分液漏斗时，要注意区别分离后的上下层溶液。第1 次，将样品与40 mL 水饱和正丁醇置于分液漏斗中，上下摇匀后，上层为正丁醇，下层为多糖与蛋白质。第2 次，将合并的正丁醇和氨试液置于分液漏斗中摇匀，上层为正丁醇与甲苷，下层为氨试液。

3 实验教学活动总结与反思

目前高职院校主要以学生专业技能的掌握为导向，注重学生的实践操作能力培养。高职院校教师应根据学生所处的不同年龄阶段，选择合理的教学方式，因材施教。

3.1 合理组织实验教学，注重以学生为中心的教学方式 为更好地组织与安排生物学实验课程，在实验教学活动开展前，教师应依据学生各方面特点进行有效分组，提前讲述实验内容，合理安排实验的准备工作。同时，每组选出组长，对整个小组的实验分工进行安排。实验过程中，教师要密切关注学生操作过程中的表现，对学生实验中的不当操作进行纠正，对学生在实验中遇见的问题进行点拨与引导。各小组可针对本组中存在的问题进行讨论与建议。最后，教师依据各组实验结果及表现进行评价，提出意见与建议。

3.2 重视因材施教，培养小组合作意识 本次实验教学活动内容多且繁琐，持续时间较长。为更好地达到实验课堂的教学目标，教师应当因材施教，促成小组合作，互相帮助。高职学生对于提取分离较为陌生，采用实验方式更加通俗，易于理解与掌握。同时实验离不开各小组成员的协作，例如高效液相流动相的制备与黄芪样品的处理，需要小组成员全部参与到实验中，共同完成实验内容，体验参与实验的乐趣。

3.3 激发学生思维碰撞，培养发现、解决问题能力 在实验教学过程中，学生进行自主交流，思维碰撞，教师辅助、引导学生反复深入思考，例如“高效液相实验结果获得平峰的原因是什么？”不拘泥于教材内容，激发学生的多向思维，培养学生发现问题、解决问题的能力。